miR-182-5p通过HOXB7基因调控膀胱癌细胞的增殖和侵袭迁移

2020-09-05肖飞辛士永邵长帅张建国高中伟

分子诊断与治疗杂志 2020年8期

肖飞辛士永邵长帅张建国高中伟

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率逐年上升。因此，揭示膀胱癌发生发展的分子机制，寻找早期诊断和治疗靶点极具意义。微小RNAs（microRNAs，miRNAs/miR）是一种内源性非编码RNA，在膀胱癌等肿瘤中扮演着重要角色［1-3］。证据表明，微小RNA-182-5p（microRNA-182-5p，miR-182-5p）在膀胱癌细胞中低表达，上调其表达可抑制癌细胞增殖和迁移侵袭［4］。但miR-182-5p 参与膀胱癌细胞增殖和侵袭迁移的分子机制尚不明确。生物学信息软件预测出miR-182-5p 可能靶向同源异型盒基因B7（homeobox B7 gene，HOXB7），并且资料显示，HOXB7在皮肤鳞状细胞癌细胞中高表达，沉默miR-182-5p 抑制癌细胞的增殖转移［5］。而miR-182-5p 是否通过靶向HOXB7 调控膀胱癌细胞的增殖和侵袭迁移，这方面的研究鲜见报道。因此，本研究考察miR-182-5p 对膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响，旨在阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂和仪器

正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1，HUU）和膀胱癌细胞（T24、5637、SW780）购自美国ATCC 公司，miR-182-5p 模拟物、阴性对照质粒（miR-NC）、荧光素酶报告载体购自上海吉玛生物有限公司，HOXB7、P53、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases2，MMP-2）蛋白抗体购自美国Cellular Signaling Technology 公司。ABI 7500 荧光定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司。

1.2 细胞培养

HUC、T24、5637、SW780 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基常规培养。

1.3 实时荧光定量PCR 检测目的基因表达

采用Trizol 试剂提取细胞总RNA，反转录成互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），按照qPCR 试剂盒说明书进行反应。条件为95℃预变性30 s；95℃变性10 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，40 个循环。收集Ct 值，以2-ΔΔCt法计算miR-182-5p、HOXB7 mRNA 相对表达量。

1.4 蛋白质印迹法（Western Blot）

细胞中加入蛋白裂解液提取总蛋白，经10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），转移到聚偏二氟乙烯膜，常温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1 h，化学发光液进行显色、曝光，以β-actin 为内参，计算蛋白相对表达量。

1.5 细胞转染、增殖

将SW780 细胞接种于6 孔板，生长至70%融合度，按照Lipofectamine 2000 试剂说明书的指示，将miR-182-5p、anti-miR-182-5p、si-HOXB7及相应的阴性对照转染入细胞。

收集转染后的SW780 细胞，以1×104个/孔的密度接种于96 孔板，培养24 h、48 h、72 h 后，每孔加入100 μL MTT 溶液，37℃孵育4 h，加入200 μL 二甲基亚砜，摇床孵育10 min，酶标仪检测细胞在490 nm 处的吸光度值（OD490nm值）。

1.6 Transwell 小室法检测细胞迁移和侵袭能力

细胞侵袭实验中，将Matrigel 胶与无血清培养基混匀，加入Transwell 上室。细胞用无血清培养基调整为5×105个/mL，吸取100 μL 于上室。下室加入含10%胎牛血清的培养基。37℃培养48 h后，用无菌棉签除去多余细胞和Matrigel 胶，甲醛固定和结晶紫染色，显微镜下拍照、计数。

细胞迁移实验中，Transwell 上室不加入Matrigel 胶，其余步骤与侵袭实验相同。

1.7 靶基因预测及双荧光素酶基因报告

利用TargetScan（http：//www.targetscan.org/）软件筛选出miR-182-5p 与HOXB7的3'非编码区（3'untranslated region，3'UTR）区域具有部分结合位点。为了证实miR-182-5p 与HOXB7是否存在靶向关系，分别构建野生型HOXB7（HOXB7-WT）和突变型HOXB7（HOXB7-MUT）的3'UTR 荧光素酶报告载体，并分别共转染miR-182-5p 模拟物，37℃、5%CO2培养48 h，收集细胞，测定双荧光素酶活性。

1.8 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计数资料用（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-182-5p 和HOXB7 在正常膀胱上皮HUC细胞与膀胱癌细胞T24、5637、SW780 中的表达

与HUC 细胞相比，T24、5637、SW780 细胞中miR-182-5p 表达量显著减少，HOXB7mRNA 和蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）见表1。

表1 miR-182-5p 和HOXB7 在正常膀胱上皮细胞和膀胱癌细胞中的表达（±s，n=9）Table 1 Expressions of miR-182-5p and HOXB7 in normal bladder epithelial cells and bladder cancer cells（±s，n=9）

分组HUC T24 5637 SW780 F 值P 值miR-182-5p 1.00±0.14 0.46±0.04a 0.58±0.07a 0.41±0.05a 90.409 0.000 HOXB7 mRNA 1.00±0.12 4.16±0.35a 3.88±0.41a 5.82±0.39a 315.752 0.000 HOXB7 蛋白0.29±0.05 0.73±0.05a 0.67±0.06a 0.88±0.08a 151.260 0.000

2.2 过表达miR-182-5p 对SW780 细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与miR-con 组比较，过表达miR-182-5p 降低SW780 细胞活力，且在48 h 和72 h 差异有统计学意义（P＜0.05）。与miR-con 组比较，过表达miR-182-5p 显著降低SW780 细胞的迁移、侵袭数（P<0.05）（图1A），P53 和MMP-2 蛋白的表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。图1B、见表2。

图1 过表达miR-182-5p 对SW780 细胞迁移、侵袭和相关蛋白表达的影响（CVS，×100）Figure 1 Effects of overexpression of miR-182-5p on migration，invasion and related protein expressions of SW780 cells（CVS，×100）

表2 过表达miR-182-5p 对SW780 细胞增殖、迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 2 Effects of overexpression of miR-182-5p on cell proliferation，migration and invasion in SW780 cells（±s，n=9）

分组miR-con miR-182-5p t 值P 值miR-182-5p 1.00±0.08 3.61±0.36 21.232 0.000细胞活力（OD490 nm）24 h 0.44±0.04 0.42±0.06 0.832 0.418 48 h 0.71±0.07 0.59±0.06 4.992 0.000 72 h 1.05±0.13 0.77±0.08 5.503 0.000细胞迁移数（个）107.65±11.27 39.26±4.53 16.892 0.000细胞侵袭数（个）48.28±5.64 18.64±4.71 12.101 0.000 P53 蛋白0.53±0.07 0.28±0.05 8.719 0.000 MMP-2 蛋白0.67±0.06 0.38±0.07 9.437 0.000

2.3 miR-182-5p 靶向调控HOXB7 表达

TargetScan 网站预测发现HOXB7的3'UTR中含有与miR-182-5p 互补的核苷酸序列（图2A）。转染miR-182-5p 模拟物明显降低HOXB7表达水平，转染anti-miR-182-5p 模拟物显著提高HOXB7 表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2B）。双荧光素酶基因报告实验发现，miR-182-5p 显著抑制野生型HOXB7（HOXB7-WT）报告基因的荧光素酶相对活性（P<0.05），而对突变型HOXB7（HOXB7-MUT）荧光素酶相对活性无显著影响，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 抑制HOXB7 表达对SW780 细胞增殖、迁移和侵袭的作用

在SW780 细胞中转染si-HOXB7载体，与si-con 组相比，si-HOXB7组细胞中HOXB7 表达量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。与si-con 组比较，si-HOXB7组SW780 细胞活力在48、72 h 时显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），P53 和MMP-2 的蛋白表达量显著下调，差异有统计学意义（P<0.05），细胞的迁移数和侵袭数均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3、表4。

图2 miR-182-5p 靶向调控HOXB7 蛋白表达Figure 2 miR-182-5p targeted and regulated HOXB7 protein expression

表3 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Table 3 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

分组miR-con miR-182-5p t 值P 值HOXB7-WT 1.00±0.13 0.59±0.06 8.591 0.000 HOXB7-MUT 0.98±0.07 1.08±0.13 2.032 0.059

图3 Western blot 检测SW780 细胞HOXB7、P53 和MMP-2 蛋白表达Figure 3 Western blot analysed expressions of HOXB7，proliferation and migration-related protein in SW780 cells

2.5 过表达HOXB7 逆转了miR-182-5p 对SW780细胞增殖、迁移和侵袭的作用

与miR-con 相比，过表达miR-182-5p 显著影响48 h 和72 h 的SW780 细胞活力、细胞迁移、侵袭数目、P53 和MMP-2 表达，差异有统计学意义（P＜0.05），与2.2 研究结果相同。另外，过表达miR-182-5p 还减少HOXB7 表达量。与共转染miR-182-5p 和pcDNA 相比，共转染miR-182-5p和pcDNA-HOXB7显著提升HOXB7、P53 和MMP-2 蛋白表达水平以及细胞迁移、侵袭数目（P<0.05），以及提高SW780 细胞活力，在48、72 h差异有统计学意义（P<0.05）。见图4和表5。

图5 SW780 细胞HOXB7、增殖和迁移相关蛋白表达Figure 5 Expressions of HOXB7,proliferation and migration-related protein in SW780 cells

3 讨论

miRNAs 通过与互补信使RNA 的3’UTR 特异性结合来调控基因表达，影响细胞功能和多种生物学过程［6-8］，可作为癌症早期诊断和治疗的生物标志物，在膀胱癌等癌症中具有良好的应用价值［9-10］。既往研究表明，在不同类型的癌症中，miR-182-5p 作为癌基因或抑癌基因发挥生物学功能。一方面，扮演癌基因的角色促进细胞增殖或转移，如miR-182-5p 在口腔鳞状细胞癌中表达上调；促进口腔鳞癌细胞增殖［11］。胃癌组织和细胞系中miR-182-5p 表达上调；miR-182-5p 下调了降低胃癌细胞的活力、迁移、侵袭和有丝分裂［12］。另一方面，miR-182-5p 作为抑癌基因，抑制肿瘤的发生发展过程，如miR-182-5p 在卵巢癌中表达下调，其上调导致卵巢癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力受到抑制［13］。在结直肠癌中，miR-182-5p 表达显著下调；结直肠癌SW620 细胞的增殖、侵袭和迁移能力被miR-182-5p 过表达所抑制，miR-182-5p 显现出抗癌作用［14］。本项实验发现，与卵巢癌［13］、结直肠癌［14］相同，miR-182-5p 在膀胱癌细胞系中的表达下调。过表达miR-182-5p 抑制膀胱癌SW780 细胞活力、迁移和侵袭能力，与Wang 等［4］研究相同。

表4 抑制HOXB7 表达对SW780 细胞增殖、迁移和侵袭的作用（±s，n=9）Table 4 Inhibition of HOXB7 expression on proliferation，migration and invasion of SW780 cells（±s，n=9）

分组si-con si-HOXB7 t 值P 值细胞活力（OD490 nm）24 h 0.42±0.04 0.38±0.05 1.874 0.079 48 h 0.68±0.05 0.45±0.04 10.776 0.000 72 h 1.09±0.07 0.76±0.08 9.313 0.000细胞迁移数（个）113.69±13.19 42.53±8.55 13.581 0.000细胞侵袭数（个）53.47±6.16 25.29±4.29 11.262 0.000 HOXB7 蛋白0.88±0.08 0.27±0.06 18.300 0.000 P53 蛋白0.63±0.07 0.31±0.08 9.031 0.000 MMP-2 蛋白0.74±0.08 0.37±0.06 11.100 0.000

表5 过表达HOXB7 逆转了miR-182-5p 对SW780 细胞增殖、迁移和侵袭的作用（±s，n=9）Table 5 Overexpression of HOXB7 reversed the effects of miR-182-5p on proliferation，migration and invasion of SW780 cells（±s，n=9）

注：与miR-con 组比较，aP＜0.05；与miR-182-5p+pcDNA 组比较，bP＜0.05。

分组miR-con miR-182-5p miR-182-5p+pcDNA miR-182-5p+pcDNA-HOXB7 F 值P 值细胞活力（OD490 nm）24 h 0.43±0.04 0.39±0.04 0.40±0.05 0.41±0.05 1.281 0.298 48 h 0.72±0.07 0.47±0.05a 0.51±0.05 0.66±0.04b 44.452 0.000 72 h 1.10±0.09 0.67±0.06a 0.74±0.06 0.96±0.09b 60.449 0.000细胞迁移数（个）109.38±10.24 38.63±3.58a 49.56±4.17 72.46±10.83b 139.513 0.000细胞侵袭数（个）58.04±5.28 18.47±4.35a 21.69±3.37 41.29±4.73b 152.102 0.000 HOXB7蛋白0.69±0.06 0.45±0.06a 0.49±0.06 0.62±0.06b 65.079 0.000 P53 蛋白0.72±0.05 0.42±0.04a 0.45±0.05 0.57±0.06b 40.324 0.000 MMP-2蛋白0.74±0.08 0.35±0.04a 0.31±0.05 0.64±0.06b 115.234 0.000

本实验发现，HOXB7mRNA 和蛋白表达在膀胱癌中表达上调，提示HOXB7可能参与膀胱癌进程。HOXB7是同源异形盒基因（homeobox gene，Hox）家族成员之一，与癌症发生发展密切相关。Huan 等［15］和Huo 等［16的研究表明，HOXB7在肝癌、胶质瘤的表达上调，下调HOXB7表达会抑制肝癌、胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。这些结果说明HOXB7具有致癌作用，可以促进癌细胞增殖和转移。本项实验同样证实了这一观点，即HOXB7对膀胱癌进程具有一定的促进作用，抑制HOXB7表达可以抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭。

在不同的肿瘤中，多个基因已被证实为miR-182-5p 的直接靶标，如丝切蛋白1（cofilin 1，CFL1）［2］、异粘蛋白（Metadherin，MTDH）［14］等。本实验结果证明miR-182-5p 抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用可能是通过靶向调控HOXB7表达来实现的。

综上所述，miR-182-5p 可以通过靶向调控HOXB7的表达，从而影响膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这为膀胱癌提供了新的治疗靶点和生物标志物。