miR-326-3p对视网膜祖细胞分化调控作用的研究

高慧芹 庄艾 张丹丹 谷平

视网膜退行性疾病主要包括年龄相关性黄斑变性 (age-related macular degeneration,AMD)、视网膜色素变性(retinal degeneration,RP)、Stargardt's病等[1]。视网膜退行性疾病虽然病因病程进展等不尽相同，但该类疾病的共同特点是: 视网膜中的关键细胞(如感光细胞、视网膜色素上皮细胞和神经节细胞)变性、死亡，患者的视功能逐渐丧失至失明，目前仍然没有好的治疗办法。近年来，随着对干细胞及其应用研究的深入，干细胞的细胞替代治疗有望为此类疾病的治疗提供新的途径。目前治疗视网膜退行性疾病的干细胞主要为胚胎干细胞、诱导多能性干细胞以及成体干细胞[2]，前两种细胞都有成瘤的可能性，相比之下，视网膜祖细胞(retinal progenitor cells, RPCs)为成体干细胞的一种，具有自我更新和分化成视网膜各类神经元的能力，因它们不具有成瘤性，并且能够免疫豁免，被认为是极具临床应用前景的替代细胞。

然而，RPCs虽能成功地从胚胎或出生后早期的视网膜中分离提取出来，但体外诱导分化的干细胞定向分化为功能性视网膜神经元的能力有限，限制了其未来的临床应用[3]，因此如何提高RPCs的分化能力，是目前该领域研究的焦点之一。针对干细胞定向分化的难题，运用基因修饰调控干细胞分化的研究日益受到关注。

微小 RNA(micro RNA，miRNA)作为重要的表观遗传调控因子广泛存在于生物界，具有高度保守性， 是长度约为18～25个核苷酸的小分子非编码RNA， 主要通过与靶基因结合，导致 mRNA 降解或翻译抑制，在转录后水平发挥表观遗传调控作用[4]。近年来，多个课题组发现一类与视网膜发育及光感受器细胞分化密切相关的miRNAs(miR-96, miR-143, miR-145, miR-183等)[5-7]能够调控干细胞分化，在本实验中，我们研究了miR-326-3p对RPCs分化的作用，旨在为干细胞移植治疗视网膜退行性疾病研究提供新的实验依据。

资料与方法

一、实验材料

RPCs从出生1 d C57BL/6小鼠的视网膜中分离，增殖培养基(进口DMEM/F12含20 ng/ml EGF、1%N2、2mM L-谷氨酰胺)，分化培养基(进口DMEM/F12含1%N2、2mM L-谷氨酰胺、10%FBS)，胰酶消化液 ( Invitrogen)，TRIzol试剂盒(Invitrogen)，逆转录试剂盒(Takara),蛋白裂解液和BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，PVDF膜(Millipore)，抗体GFAP(Chemicon)、抗体PKC-a(BD)、抗体Recoverin(Millipore)、抗体Rhodopsin(Chemicon)、抗体β 3-tubulin(Chemicon)、抗体β-actin (Sigma)、 抗体- rabbit/mouse IgG(Sigma)。

二、细胞处理及分组

分离后的RPCs种植于增殖培养液中，3 d后消化传代，定期传代换液。在分化培养基中培养RPCs,分别于于0、1、4、7 d提取培养细胞的总RNA和蛋白，经qPCR实验和Western blotting实验检测RPCs分化指标GFAP、PKC-a、Recoverin、Rhodopsin和β 3-tubulin的表达水平变化以及miR-326-3p的表达水平变化。把RPCs细胞随机分为3组，分别为对照组(Control组)、miR-326-3p过表达组(Mimics组)和miR-326-3p敲降组(Inhibitors组)，在分化培养基中培养待细胞融合至70%后，分别转染miR-326-3p-Control、Mimics和Inhibitor,转染72 h后，再次转染miR-326-3p-Control、Mimics和Inhibitors，再次转染48～72 h后分别收取3组细胞的RNA和蛋白样本，用于后期的qPCR实验和Western blotting实验。

三、实验方法

1. RNA提取和qPCR实验：使用Trizol提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒反转获得cDNA(方法如厂家所述)。随后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，以 β-actin和U6分别为mRNAs和miRNAs的内参。PCR 引物序列: GFAP Forward (5′-3′)：agaaaaccgcatcaccattc，Reverse (5′-3′)：tcacatcaccacgtccttgt；PKC-a Forward (5′-3′)：cccattccagaaggagatga，Reverse (5′-3′)：ttcctgtcagcaagcatcac；Rhodopsin Forward (5′-3′)：tcaccaccaccctctacaca，Reverse (5′-3′)：tgatccaggtgaagaccaca；Recoverin Forward (5′-3′)：atggggaatagcaagagcgg，Reverse (5′-3′)：gagtccgggaaaaacttggaata；

β 3-tubulin Forward (5′-3′)：cgagacctactgcatcgaca，Reverse (5′-3′)：cattgagctgaccagggaat；

β-actin Forward (5′-3′)：agccatgtacgtagccatcc，Reverse (5′-3′)：ctctcagctgtggtggtgaa；miR-326-3p Forward(5′-3′)：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagactggagg，Reverse (5′-3′)：acactccagctgggcctctgggcccttcct；

U6 Forward(5′-3′)：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaacgc，Reverse (5′-3′)：acactccagctgggacgcaaattcgtgaag；

2. 蛋白提取及Western blotting：用含蛋白酶抑制剂裂解液提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，95 ℃煮沸10 min，按每孔20 μg蛋白量，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离蛋白。转膜90min后，5%脱脂奶粉的吐温磷酸缓冲液(PBST)封闭1 h，一抗(1:1000)4 ℃孵育过夜，PBST洗3次膜，二抗(1:2000)孵育1 h，PBST再洗膜3次，随后使用ECL化学发光液进行显影拍照。

四、统计分析与图标的制作

结 果

一、RPCs分化过程中分化指标的表达变化

在RPCs细胞分化过程中，RPCs分化特异性指标GFAP、PKC-a、Rhodopsin、Recoverin和β 3-tubulin的mRNA和蛋白表达水平都不断地增加(图1)。

二、RPCs分化过程中miR-326-3p表达水平逐渐增加

RPCs分别在分化培养基中培养0、1、4、7 d，qPCR实验证明RPCs分化过程中内源性miR-326-3p的mRNA表达水平不断地增加，提示miR-326-3p可能在RPCs细胞分化中发挥重要作用(图2)。

三、检测miR-326-3p过表达敲降效率

RPCs转染48 h后，收取样本，检测3组细胞中miR-326-3p表达量的变化，相对于对照组，过表达miR-326-3p组中其表达量明显地增加，而敲除miR-326-3p组中其表达量明显地降低，表明转染成功(图3)。

四、miR-326-3p促进RPCs细胞的分化

过表达miR-326-3p后，在mRNA和蛋白水平RPCs分化指标GFAP、PKC-a、Rhodopsin、Recoverin和β3-tubulin相比较于对照组都有明显的增加，表明miR-326-3p促进RPCs分化，特别是向视网膜神经元细胞分化能力增强(PKC-a、Rhodopsin、Recoverin表达量上升的更加明显)；而敲除miR-326-3p后，这些分化指标相比较于对照组都有明显的降低，表明敲除miR-326-3p后抑制RPCs的分化(图4)。

讨 论

视网膜退行性疾病，其特征是视网膜神经元细胞的逐渐丧失，导致视力的不可逆下降，甚至失明。由于变性和凋亡的神经细胞不能再生，干细胞移植是最具临床应用前景的治疗方法[8]。目前治疗视网膜退行性疾病的种子细胞主要包括视网膜祖细胞(RPCs)、胚胎干细胞和诱导多能干细胞，三种干细胞中，从视网膜分离的RPCs因没有成瘤和免疫反应等问题成为干细胞移植治疗首选细胞[9]。

RPCs可以与视网膜整合，分化为视网膜神经元细胞，形成突触连接，甚至改善视觉功能[10-12],但其向视网膜神经元分化能力有限，是其未来临床应用的潜在的重要障碍。越来越多的研究表明，microRNA对决定干细胞的命运有着至关重要的影响[13]。本课题组也先后发现一群miRNAs(miR-9, let-7b,miR-29a等)对RPCs的增殖分化具有重要调控作用[14-16]。在本研究中，我们的数据表明，内源性miR-326-3p在RPCs的分化过程中表达量明显地上调，过表达miR-326-3p后RPCs分化能力明显增强。综上所述，我们的实验证明了miR-326-3p促进RPCs的分化。未来的研究我们将进一步阐明miR-326-3p如何对RPCs分化起到促进作用，以及miR-326-3p在视网膜发育和体内功能中的具体作用，以期为视网膜祖细胞移植治疗视网膜退行性疾病提供新的思路和方法。

综上所述，外源性过表达 miR-326-3p后促进RPCs分化，特别是向视网膜神经元细胞分化能力增强，我们可以通过对RPCs基因修饰作用以促进其向视网膜神经元方向分化的作用，为视网膜祖细胞的移植治疗提供新的实验依据。