不同激素组合对蝴蝶兰快繁苗品质的影响

李 菁，林 蔚，王晶晶，王雪妮，范正阳，郑文高，兰思仁，何碧珠，2*

（1.福建农林大学园艺学院，福建福州350002；2.兰科植物保护与利用国家林业与草原局重点实验室，福建福州350002；3.福建农林大学园林学院，福建福州350002）

蝴蝶兰（Phalaenopsis aphroditeRchb. F. ）为兰科蝴蝶兰属，其形如蝶，色彩丰富，在洋兰当中最受人们的喜爱，其盆栽花的产量和销售量随着人民生活水平的提高也逐年提高。蝴蝶兰在冬季10℃下会停止生长，低于5℃容易死亡，温度是限制蝴蝶兰生长的重要因子之一[1]。由于蝴蝶兰是单茎性气生兰，很难进行常规的分株繁殖，其产量满足不了市场的需求，因此大多采用组织培养繁育种苗。近年来，对于蝴蝶兰组培快繁采用的外植体较多的有胚[2]、幼叶[3]、茎尖和根尖[4]、花梗腋芽[5]、花梗节间[6]等，均取得一定的研究成果。该试验主要以蝴蝶兰花梗侧芽为材料，进一步探究并筛选出花梗侧芽诱导营养芽、幼叶诱导丛生芽、根尖诱导原球茎以及生根培养的最适宜培养基配方，以期为蝴蝶兰的生产发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料取自蝴蝶兰专业组培生产工厂内培养的花期中的白花蝴蝶兰，以蝴蝶兰花梗侧芽为外植体。

1.2 方法

1.2.1 诱导培养。（1）花梗侧芽诱导营养芽。将带有侧芽的蝴蝶兰花梗剪成2～3 cm 长节段，用自来水冲洗干净材料表层，在饱和漂白粉上清液中浸泡15 min 并不断搅动，浸泡后的花梗侧芽在自来水下冲洗30 min 后，纯水冲2～3 次，置于超净工作台中，用75%酒精灭菌30 s，用5%次氯酸钠溶液消毒10 min 后，用无菌水冲洗3～4 次备用。每一种培养基配方接种带侧芽的花梗数20 个（表1），观察其发芽情况，30 d 后记录发芽个数，并算出各种培养基配方下花梗侧芽的出芽率。（2）茎尖诱导原球茎。将诱导出来的营养芽的叶片逐层剥下，切取2 mm 茎尖，在茎尖顶端用手术刀慢慢划几刀，然后接种在诱导原球茎状体培养基上（表2）。每种培养基配方接种茎尖20 个，观察其生长变化过程，50 d 后记录诱导出原球茎的茎尖数，并计算出每种培养基配方下茎尖的诱导率。（3）叶片诱导丛生芽。将诱导出来的营养芽的叶片切成1.2 mm 左右大小，平放于不同诱导培养基中（表3）诱导丛生芽。每种培养基均接种叶片30 片，观察其生长变化过程，50 d 后记录诱导产生丛生芽的叶片数，并计算每种培养基的诱导率。

表2 茎尖诱导原球茎的培养基配方(基本培养基MS)

表3 叶片诱导丛生芽的培养基配方(基本培养基MS)

1.2.2 继代培养。

（1）原球茎的增殖及分化。在超净工作台中，在诱导的原球茎状体变绿之前取出，将其横切成小块，直径为3 mm，并给予针刺，转移到新鲜培养基中培养，每瓶培养块数10 块左右（表4）。观察增殖培养过程中原球茎增殖状况，30 d 后量取每块原球茎的直径，计算每种培养基配方原球茎增殖后的平均直径，并计算其增殖系数。

（2）丛生芽的增殖培养。在超净工作台中，将诱导产生的高约1～1.5 cm 的丛生芽从瓶中取出，切去叶片和基部褐化部分，转接到含有不同激素浓度的1/2MS 培养基中增殖培养50 d（表5）。每种培养基配成10 瓶，每瓶接种3 个不定芽，50 d 后记录增加的不定芽的个数，计算每种培养基的增殖倍数。

1.2.3 生根培养。当丛生芽长至1.5～3 cm 高，2～3 片叶时，将其分成单个植株，接入不同的生根培养基中诱导生根（表6）。每种培养基接种50 株，50 d 后记录生根株数及每株的生根数，并计算各种生根培养基下幼苗的生根率及平均生根数。

表4 原球茎状体增殖的培养基配方(基本培养基1/2MS)

表5 丛生芽增殖的培养基配方(基本培养基1/2MS)

表6 蝴蝶兰试管苗生根培养的培养基配方(基本培养基1/2MS)

1.2.4 培养基及培养环境条件。以MS、1/2MS 为基本培养基，根据试验不同目的和培养阶段，添加不同种类和浓度的植物激素（细胞分裂素BA、a-萘乙酸NAA、吲哚乙酸IBA、激动素KT）、活性炭（AC）、香蕉汁，所有的培养基均加有2%蔗糖、0.7%琼脂、pH 5.5～5.8；培养环境条件为温度（23±2）℃，光照强度为1 500～2 000 lx，光照时数10 h/d。

1.2.5 试管苗移栽。当生根苗苗高3～5 cm，具有3～4 片叶片时便可移栽。先在室内炼苗4 d，再在室外炼苗4 d[7]。炼苗后取出幼苗，用清水洗净幼苗根部的培养基，0.1%的高锰酸钾浸泡5 min 后，分别移栽到水苔（消毒处理）、谷壳和椰糠3 种不同的基质中，保持基质湿润和空气适度及通风。从出瓶到移栽各个环节，注意避免苗木受伤。培养条件是白天27℃～29℃，晚上23℃～26℃，相对湿度70%～80%，光照强度6 000～8 000 lx。

2 结果与分析

2.1 诱导培养

2.1.1 花梗侧芽诱导营养芽。蝴蝶兰花梗侧芽接种到添加不同激素浓度的MS 培养基上，接种1 周后侧芽开始萌动膨大（图1A），花梗的基部有褐色物质产生，25 d 后长出小叶（图1B）。

各培养基均能诱导出营养芽，但是激素的种类和浓度对蝴蝶兰花梗侧芽诱导营养芽有很大的影响，其中以A3 的培养基出芽率最高，MS 培养基中单独添加激素BA的出芽率要比BA 和NAA 配合使用更高（表1 和表7）。

表7 不同激素浓度对蝴蝶兰花梗侧芽诱导营养芽的影响（基本培养基MS)(30 d 记录）

2.1.2 茎尖诱导原球茎状体。不同激素组合对原球茎状体诱导率影响，诱导效果以B9 培养基最佳。所有组合都能够诱导出原球茎状体，但是经观察B1、B2 和B3 诱导的原球茎很难繁殖，甚至有些不能够正常生长，这说明BA配合NAA 使用比BA 单独使用更适宜茎尖诱导原球茎；当NAA 的浓度一定时，原球茎的诱导率随着BA 浓度的升高而增加，说明BA 浓度越高，对诱导原球茎的促进作用越强；当BA 浓度一定时，随着NAA 浓度的增加，诱导率先升高后降低，说明低浓度NAA 对于茎尖诱导原球茎有促进作用，但是高浓度NAA 则会抑制其诱导（表2 和表8）。

表8 不同激素浓度对茎尖诱导原球茎的影响(基本培养基MS)(50 d 记录)

2.1.3 叶片诱导丛生芽。利用诱导产生的营养芽的叶片在MS 培养基上进行丛生芽的诱导，附加不同浓度的激素，并添加100 g/L 的香蕉汁。约在15～20 d 时，在周边陆续出现淡绿色的不定芽（图2），30～50 d 形成丛生芽。不同浓度激素对于叶片诱导丛生芽有不同的影响，但都能诱导丛生芽的产生，其中以C6 培养基的诱导率最高，可见叶片诱导丛生芽需较高浓度的BA 和中等浓度的NAA 及香蕉汁混合使用（表3 和表9）。

表9 不同激素浓度对叶片诱导丛生芽的影响（基本培养基MS）（50 d 记录）

表10 不同激素浓度对原球茎状体增殖的影响（基本培养基1/2MS）（30 d 记录）

2.2 继代培养

2.2.1 原球茎的增殖及分化。在诱导产生的原球茎状体转绿之前，将原球茎状体切成小块，转移到增殖培养基上，培养25 d 左右时，每个原球茎周围产生少量肉眼可以看得见的突起（图3A），少数原球茎表面形成白色绒毛（图3B）。不同浓度的BA 和NAA 组合对原球茎状体的增殖有显著的影响，其中以D8 培养基中原球茎的增殖速度最快，增殖系数达2.3，（表4 和表10）。原球茎在BA 和NAA 配合使用的培养基中的增殖速度要比BA 单独使用快；当NAA 浓度一定时，原球茎的增殖速度随着BA 浓度的升高先增加后下降，说明原球茎的增殖需要适宜浓度的BA，但高浓度的BA 会刺激多酚氧化酶作用，使原球茎容易产生褐化[8]；当BA 浓度一定时，原球茎的增殖系数随着NAA 浓度的增加先增大后下降，这与周俊辉等[9]的研究结果相似，原球茎的分化比较容易，在其增殖后较长时间不进行转移即可变绿分化。试验中继续培养时发现，原球茎由淡黄色转变为绿色，成为具有绿色叶原基的假鳞茎原球茎，进而分化成苗。

2.2.2 丛生芽的增殖培养。在增殖培养的过程当中，蝴蝶兰丛生芽的增殖倍数都随着BA 和NAA 浓度的增高而增大，最大为4.33（图4 和表11）。但是由于增殖倍数太高会出现变异现象，增殖倍数太低又会影响蝴蝶兰工厂化生产的价值和意义。因此该试验以增殖倍数为4 上下相对比较安全，最佳的增殖培养基为E9。

2.3 生根培养

将以上2 种增殖途径获得的高约1.5～2.0 cm 的丛生芽分成单个植株接入不同的生根培养基中，50 d 后的生根效果（图5），在基本培养基1/2MS 中，添加AC0.1%，不同浓度的IBA 与NAA 配比对蝴蝶兰的生根效果不一。低浓度的IBA 和NAA 配比下，生根率都很低，随着IBA 浓度的升高，生根率也逐渐升高。在相同的IBA 浓度下，不同浓度的NAA 对蝴蝶兰生根也有影响，浓度越高生根率越高。当IBA 浓度为1.0 mg/L，NAA 为0.3 mg/L 时，蝴蝶兰的生根率最高。但比较F8 和F9 2 组结果发现，NAA 浓度为3.0 mg/L 时，IBA 浓度升高，生根率有微小的下降，说明在蝴蝶兰生根培养基当中，IBA 的浓度不宜过高。因此，蝴蝶兰生根培养基以F8 为宜（图5 和表12）。

表11 不同激素浓度对丛生芽增殖的影响（基本培养基1/2MS）（50d 记录）

表12 不同激素浓度对蝴蝶兰生根的影响（基本培养基1/2MS）（50d 记录）

2.4 试管苗的出瓶移栽

水苔、谷壳、椰糠3 种不同栽培基质中，以水苔的栽培成活率最高，这是因为蝴蝶兰属热带气生兰，具气生根，栽培上要求根部通气良好（表13）。谷壳和椰糠因为基质颗粒太细，会导致栽培基质透气性稍差。另外椰糠的保水能力很强，稍有管理不当就容易引起烂根。所以，蝴蝶兰幼苗移栽的基质材料以水苔为主，成本低，又能营造湿润透气的生长小环境。

表13 不同基质对蝴蝶兰组培苗移栽成活率的影响

3 小结与讨论

3.1 蝴蝶兰组培快繁技术部位选择探讨

目前蝴蝶兰组培快繁技术的方法主要有2 种：一是原球茎途径；二是丛生芽途径。该试验以花梗侧芽为外植体，诱导其产生营养芽，再利用营养芽的茎尖和叶片分别诱导原球茎和丛生芽，将蝴蝶兰组培快繁的2 种方式同时进行，并筛选出蝴蝶兰组培快繁各个环节的最佳培养基配方。其中，蝴蝶兰组培快繁外植体的选择以花梗侧芽为最好。而花梗侧芽离基质远，且侧芽有苞片包被，带菌少，灭菌后成活率也高。顾伟民[10]等研究结果表明，蝴蝶兰不同外植体的成活率有差异，其中以花梗侧芽的成活率最高，可达到75%，其次是花梗，达62.5%，叶片和根尖最差。

在茎尖诱导原球茎和原球茎状体增殖培养这2 个试验步骤中，采取了茎尖顶端切割和原球茎状体针刺的处理。张元国[11]等通过试验发现，切割或者针刺茎尖对诱导原球茎影响最大，切割茎尖顶端诱导率高达100%，不切割诱导率明显下降，剩40%，将茎尖切成小块不利于原球茎状体的诱导，诱导率只有20%。茎尖顶端切割能够刺激茎尖分生组织细胞的活性，能明显提高原球茎状体的诱导率；增殖时针刺原球茎状体有利于增殖而控制分化，否则原球茎很容易转绿分化和生根。

苏悦等[12]认为，原球茎状体增殖时有群体优势效应，同一空间内原球茎和幼苗存在争夺营养、互相胁迫的现象，因此刚诱导出的原球茎状体不宜过早切割转移，增殖时切割块的大小应不小于3 mm，且接入原球茎的块数不宜过少，这样的增殖系数高，分化出的幼苗少。

3.2 防止蝴蝶兰组培褐化现象探讨

梁宏伟等[13]指出，添加1～2 g/L 活性炭对原球茎的和幼苗的生长具有积极作用，可以防止培养材料出现褐化。因此在原球茎增殖培养、丛生芽增殖培养和生根培养的过程中都加入了活性炭，一定程度上降低了材料的褐变现象。

3.3 蝴蝶兰组培有机添加剂选择探讨

组织培养常用到的有机添加剂有椰子汁、香蕉汁和土豆汁，其含有氨基酸、激素和酶等较为复杂的天然复合物，对于细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用[14]。何松林等[15]以白花蝴蝶兰的原球茎为材料，在原球茎幼苗分化培养基中分别添加了椰子汁、马铃薯汁和香蕉汁3 种有机添加物均能提高原球茎的增殖率，且椰子汁和马铃薯汁的效果更优。该研究考虑到成本问题，以香蕉汁作为有机添加物效果较为理想，有效地促进了芽的增殖和分化。