液相色谱-串联质谱法检测仙草中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的残留

2020-09-03张健希

质量安全与检验检测 2020年4期

张健希

（盘锦检验检测中心（盘锦市疾控中心）辽宁盘锦 124010）

1 前言

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）是在阿维菌素B1的基础上通过化学结构修饰形成的大环酯类化合物，是一种高效半合成生物性毒杀虫剂。根据R基取代基的碳原子数不同可分为B1a和B1b两种成分[1]。其中，前者成分高于90%，属于神经性毒剂，尤其对同翅目等昆虫具有显著的防治效果，这种药物长期使用不会产生抗药性[2]。目前，甲维盐已经成为国内水果、蔬菜以及农作物病虫害防治等的主要产品，但如果过量使用会污染环境，同时也会给其他非靶标生物带来不利影响。现有研究发现，甲维盐对家蚕、蜜蜂半数致死量（LD50）数值较低，进一步说明该药物对于上述生物具有一定的毒性。目前国内标准规定，大多数农作物中甲维盐的最大残留量为0.02μg/kg，而在欧盟国家要求其最大残留量为0.01 μg/kg。国际食品法典委员会（CAC）有关规定要求，棉花籽中该农药的最大残留量为0.02μg/kg[3]。

当前研究学者主要采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行阿维菌素类药物残留分析检测，同时还会采用荧光检测器、紫外检测器等方式，但由于荧光检测过程中衍生条件不稳定，样品分析结果不够理想，检测器灵敏度较低，无法达到国家限量标准中部分类别的限值要求[4]。在土壤、蔬菜、水果、水质等基质中，可以采用LC-MS/MS进行阿维菌素类药物的检测，但该研究并没有在仙草植株等复杂样品中进行。

2 材料和方法

2.1 仪器材料

仪器设备：液相色谱-串联质谱仪（配备三重四级杆串联质谱、ESI电喷雾离子源）；高速匀浆机；旋转蒸发仪；氮吹仪；固相萃取装置；涡旋混合器；超声波清洗仪；电子天平；移液枪。

试剂：甲氨基阿维菌素苯甲酸盐B1a标准品；乙腈、甲醇（色谱纯）；磷酸、氯化钠、乙酸乙酯、醋酸铵（分析纯）。

2.2 质谱、色谱条件

液相色谱条件：色谱柱型号为ACQUITY UPLC BEH C18（1.7μm，2.1mm×50 mm），柱温设置为 40℃，进样量为5 μL。流动相A相为乙腈，B相为5 mmol/L醋酸铵水溶液，流速为0.3 mL/min。设置洗脱程序为：0～1 min内用 10%的流动相 A 洗脱；1～2.5 min内流动相A的比例逐渐增加到95%；2.5～4 min流动相A保持95%洗脱；4～4.5 min内流动相A浓度降低到10%之后，系统平衡。

质谱条件：采用电喷雾离子源、正离子扫描、多反应监测模式进行质谱检测，毛细管电压参数为5500V；离子源温度 TEM：600℃；气帘气（CUR）：20 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；甲维盐 B1a 的质谱参数为母离子质荷比、子离子质荷比分别为886.4、126，158；定性定量离子质荷比为158；停顿时间：0.1 s；碰撞能量分别为 34、39 eV。

2.3 样品前处理分析

准确称取10 g（精确到0.01 g）样品，将其置于50mL离心管中，加入乙腈和乙酸乙酯（体积比为1∶15）提取液20 mL，于高速匀浆机中匀浆处理1 min后，向离心管中加1 g干燥后的氯化钠，充分振荡混匀后，以5 000 r/min的速度进行样品离心，收集上层乙酸乙酯，再向原离心管内加入15 mL乙酸乙酯，再次萃取，合并2次萃取液，等待净化。在净化过程开始前依次用10 mL 1%磷酸、甲醇、水、甲醇、乙酸乙酯进行固相色谱柱的预活化。当溶剂流到吸附填充料表面之后需要将样品萃取液转移到固相色谱柱中，再使用3 mL乙酸乙酯进行淋洗，去除淋洗液之后，采用10 mL醋酸铵和甲醇混合液进行洗脱，将所收集的洗脱液经旋转蒸发仪蒸发到近干，之后向其中加入1mL甲醇进行溶解，依次加入4mL水、5mL乙酸乙酯经过混合萃取之后，静置10 min，进行上清液的收集，可以加入5 mL乙酸乙酯于上层液中，再次萃取收集萃取液，经氮吹后定容于2mL的甲醇中[5]。

2.4 绘制标准曲线

在容量瓶中加入0.1 g甲维盐标准品，用甲醇溶解，配制成100 mg/L的标准储备液，在使用过程中将其稀释到不同梯度浓度：1、5、10、50、100、200 ng/mL进行标准曲线绘制。同时，采用仙草空白机制，配制浓度基质溶液，进样量为5 mL，通过上机响应之后可获得甲维盐的基质标准曲线。

3 研究结果

3.1 条件优化

甲维盐溶于大部分有机溶剂，在荧光检测过程中需要使用乙腈提取样品，将样品浓缩后经过衍生无须净化，该方法的衍生过程条件复杂，易受外界因素的干扰，导致最终结果准确性和稳定性相对较差[6]。本文选择乙腈、丙酮、乙酸乙酯3种溶剂进行样品提取，最终采用乙腈和乙酸乙酯能够完全提取甲氨基阿维菌素，乙酸乙酯浓缩后易于开展后续的净化操作，且对环境污染程度较小，因此，最终选取乙酸乙酯作为样品提取溶剂。

净化过程中分别采用不同的固相萃取柱进行净化效果分析，其型号有NH2柱、C18柱和PCX小柱等。阿维菌素和甲氨基阿维菌素虽然从理论上看是同种药物，但由于甲维盐结构上存在甲氨基，相比阿维菌素药物其性质存在较大差异，尤其在净化和样品提取中差异较大，所以所使用的净化条件不同。本文使用标准品直接进行萃取，在NH2柱以及C18柱中均有一定程度的甲维盐保留，其回收率分别达86%和45%，使用固相色谱柱PCX进行净化后其回收率达95%以上，由于分子结构中含有甲氨基，表现为弱碱性，采用强阳离子交换柱，对甲维炎修复性较好，同时仙草植株提取液中本身存在色素，利用固相色谱柱可去除非极性色素产生的干扰影响，以降低色素本身对系统的污染性，进而提升样品分析的灵敏度，但经过PCX柱净化的洗脱液中有部分醋酸铵，因此无法直接质谱分析，需要利用乙酸乙酯经萃取浓缩后再定容上机。

3.2 仪器条件的优化

本研究中C18色谱柱对甲维盐具有较强的保留性，流动相分别为乙腈-水、甲醇-水、乙腈-醋酸铵3种溶液，经过检测发现使用醋酸铵作为流动相能够促进物质离子化，进一步提高质谱的响应值，最终选择乙腈-醋酸铵作为本次试验的流动相。甲氨基阿维菌素在自然界中性质不稳定，经过化学改造修饰之后会以甲维盐的方式存在，其分子量为1008.24，在试验中针对该物质扫描时未发现母离子峰，主要是由于在水介质中甲维盐会解离出甲氨基阿维菌素以及苯甲酸盐。因此，在质谱分析时需要以甲氨基阿维菌素作为研究对象，其母离子峰为886.38。对离子源温度、毛细管电压等参数进行优化之后，设定能够达到最高的母离子强度，选定母离子之后，进行子离子扫描，获得二级质谱图，根据该图可确定经过裂解之后的特征离子碎片为158.35和82.74，进而可以推测这2个子离子峰分别为甲氨基阿维菌素和苯甲酸盐，针对去簇电压、碰撞能量进行优化，对特征离子碎片灵敏度最佳的仪器参数详见表1。

表1 特征离子碎片灵敏度最佳的仪器参数

3.3 基质效应及线性方程

在1～200 ng/mL的线性范围内加入甲维盐标准品，最终定量离子色谱峰的面积与物质浓度具有良好线性关系，分别利用甲醇以及仙草基质进行上机分析，最终标准方程分别为Y=77120.9X+364327、Y=50256.8X+218.418。上述方程的相关系数均高于0.999，除此之外，基质和标准溶液曲线斜率比能够反映质谱基质的效应度，仙草基质和纯溶剂标准曲线方程斜率为1.18，可进一步得出，仙草样品具有较强基质抑制作用，使用纯溶剂绘制标准曲线会使结果低于实际值，在样品定量中可以利用基质配标法进行上样。

3.4 方法准确度和精密度

通过质谱以及色谱优化之后，在仙草样品中检测甲氨基阿维菌素的检出限为0.05 μg/kg，测定下限为0.1 μg/kg，其灵敏度可满足相关的样品检测要求。对于空白样品在 0.1、10、50 μg/kg 3 个水平下加标，分别为低标、中标、高标条件，进行甲氨基阿维菌素加标回收测定，具体结果详见表2。

表2 甲氨基阿维菌素加标回收测定结果

根据该结果可以得知，加标样品回收率可达70%～100%，符合检测的准确性需求，相对标准偏差介于0.3%～8.2%，符合相关的检测方法精密度需求，甲维盐标准品、仙草空白样品加标样品和实际样品中甲氨基阿维菌素的质谱图详见图1～图3。

4 讨论

采用液相色谱质谱法检测仙草中常用杀虫剂的材料报道较少，虽然目前针对阿维菌素等相关农药的检测方法较多，包括液相色谱、气相色谱等，但这些方法的样品前处理过程比较烦琐。吴宇宽等[7]利用液相色谱加热电喷雾串联质谱法对蔬菜水果中阿维菌素以及甲维盐进行检测，张武等[8]采用液相色谱法对稻米中阿维菌素以及甲维盐残留进行检测。

图3 实际样品中甲氨基阿维菌素的质谱图

阿维菌素类农药是一种非典型非极性物质，难溶于水，易溶于极性有机溶液，因此在提取阿维菌素农药残留的过程中，大多采用乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂。在研究中发现，乙酸乙酯对阿维菌素的提取效率较高，因此本文选取乙酸乙酯作为提取溶剂。此外通过研究发现，乙酸乙酯对仙草中甲维盐具有良好的提取效率，由于仙草中含有大量的色素、蛋白质等极性物质，这些物质会使液相色谱图中出现较多的杂质峰，进而干扰最终的检测结果[9]。本文利用液相提取液将水相、有机相进行分离，使大多数极性组分在水相中溶解，从而减少杂质的干扰。研究证明，样品经过前处理后杂质干扰较少。本研究构建了仙草中甲维盐残留样品前处理方法并利用LC-MS/MS上机检测，分别考察了不同净化条件、质谱条件以及提取条件，进行条件优化后，最终获得的条件具有良好的灵敏度、重复性和准确性。该方法能够在分析过程中缩短检测时间，具有较高灵敏度，并且可实现定量定性分析，符合国内外对仙草中甲维盐残留限量值的检测标准[10]。