授精第3天4～5-细胞胚胎的利用价值

宋冰冰，呼琳，郝好英，贾楠，李昊雨，殷宝莉

(河南省人民医院生殖医学研究所，河南 郑州 450003)

人类胚胎冻融技术已经在辅助生殖技术中成功应用了30余年，尤其是玻璃化冷冻技术使得胚胎的冻融变得更加高效、便捷[1]。冻融胚胎的质量与临床结局密切相关[2]。判断胚胎质量好坏的主要依据为胚胎的形态学评分，包括胚胎的生长速度、胚胎碎片和胚胎的均一性等。目前各生殖中心对于授精第3天胚胎的冷冻标准不同，本生殖医学研究所选择授精第3天细胞数≥4、胚胎碎片≤25%且比授精第2日至少生长1个细胞的胚胎进行冷冻。通常认为卵裂球分裂慢的胚胎的发育潜能和临床结局差，此类胚胎是否有利用价值尚待证实。本研究通过对489例冻融移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)的患者进行分析，探讨授精第3天4～5-细胞胚胎的利用价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象回顾性分析2017年1月至2018年12月河南省人民医院生殖医学研究所489例接受FET助孕患者的资料。依据胚胎移植个数和胚胎发育情况将患者分为A组(移植1枚4～5-细胞胚胎，29例)、B组(移植2枚4～5-细胞胚胎，34例)、C组(移植1枚4～5-细胞胚胎和1枚优质卵裂期胚胎，156例)、D组(移植1枚优质卵裂期胚胎，211例)和E组(移植1枚冷冻复苏的囊胚，来源于新鲜周期4～5-细胞胚胎的体外延长培养，59例)。纳入标准：(1)女方年龄≤40岁；(2)女方子宫内膜厚度≥6 mm；(3)采用玻璃化冷冻胚胎。排除标准：(1)严重的子宫畸形、子宫肌瘤、宫腔粘连和宫腔积液等；(2)供卵患者。本研究经医院医学伦理委员会批准通过，被研究者均已签署知情同意书。

1.2 胚胎评分及冷冻标准卵裂期胚胎评分：1级为胚胎卵裂球大小均匀，排列规则，数目 7～9个，胚胎碎片≤5%；2级为胚胎卵裂球大小欠均匀或欠规则，胚胎碎片10%～20%；2.5级为胚胎卵裂球大小欠均匀或欠规则，胞质有颗粒现象，胚胎碎片<25%；3级为胚胎卵裂球大小不均匀或不规则，胞质有颗粒现象，胚胎碎片>25%。其中1、2、2.5级为可利用胚胎，而1级为优质胚胎[3]。采用Gardner评分系统对囊胚进行评分[4]。

1.3 胚胎冷冻复苏对所有胚胎均采用玻璃化冷冻复苏，冷冻复苏试剂和载杆均购自加藤公司(Kitazato BioPharma Co.)。严格按试剂盒说明书中的方法进行操作。

1.4 观察指标移植后2周血β-人绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)≥50 U·L-1为生化妊娠，移植后4周阴道超声检查可见孕囊者为临床妊娠。着床率=(孕囊数/总移植胚胎数)×100%，临床妊娠率=(临床妊娠例数/移植患者例数)×100%，早期流产率=(孕12周内自然流产例数/临床妊娠例数)×100%，分娩率=(分娩数/移植周期数)×100%[5]。

2 结果

2.1 基本情况5组女方年龄、子宫内膜厚度、不孕年限比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 5组患者基本情况比较

2.2 临床结局E组着床率高于A组、B组、C组和D组，D组着床率高于A组和B组(均P<0.05)。E组临床妊娠率高于A组、B组和D组，C组和D组的临床妊娠率均高于A组(均P<0.05)。5组早期流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。E组分娩率高于A组、B组和D组，C组分娩率高于A组和D组(均P<0.05)。见表2。

表2 各组临床结局比较(%)

3 讨论

在控制性促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)过程中，患者使用大量的促性腺激素会引起子宫内膜功能及形态出现一定的变化[6]，造成胚胎与子宫内膜发育不同步，降低助孕的成功率。FET可以使子宫内膜同步化，从而获得较好的临床结局。近年来大量研究已经证明胚胎移植的临床结局与胚胎质量密切相关，而判断胚胎质量好坏的主要依据为胚胎的形态学评分，包括胚胎的生长速度、胚胎碎片和胚胎的均一性等。在胚胎实验室工作中，经常存在发育缓慢的胚胎，授精第3天胚胎细胞数≤5。通常认为胚胎发育缓慢可能是因为卵子在发育能力上有缺陷或者染色质异常。对于这部分发育缓慢的胚胎是否有利用价值，各个生殖中心看法不一。在本研究中，对授精第3天细胞数≤5的胚胎根据患者的意愿可以选择体外囊胚培养，养成囊胚后进行冷冻。若患者不同意体外囊胚培养，则直接在授精第3天冷冻4～5-细胞胚胎。

目前研究认为女方年龄、子宫内膜厚度和不孕年限均与胚胎移植的临床结局密切相关[7-8]。本研究中各组女方年龄、子宫内膜厚度和不孕年限无明显差异。E组着床率最高，达到76.27%。这说明授精第3天4～5-细胞胚胎延长体外培养形成的囊胚冷冻复苏后具有很好的着床能力，与夏兰等[9]研究结果一致。D组着床率高于A组和B组，说明4～5-细胞胚胎的着床能力低于授精第3天优质胚胎的着床能力。E组临床妊娠率高于A组、B组和D组，说明4～5-细胞胚胎通过体外囊胚培养可以获得较好的临床结局。C组临床妊娠率高于A组，表明同时移植1枚4～5-细胞胚胎和1枚优质卵裂期胚胎可以获得较好的临床结局。早期流产的原因很多，主要可能与胚胎染色体异常、母体子宫环境、母体内分泌因素和外界接触环境等有关。本研究中5组患者早期流产率无明显差异。E组分娩率高于A组、B组和D组，说明4～5-细胞胚胎延长体外培养形成的囊胚具有很好的发育潜能，直至最终分娩。C组分娩率高于A组和D组，即同时移植1枚4～5-细胞胚胎和1枚优质卵裂期胚胎比单独移植1枚4～5-细胞胚胎或单独移植1枚优质卵裂期胚胎的分娩率更高。这表明授精第3天4～5-细胞胚胎是具有利用价值的。

然而体外囊胚培养是一个自然筛选和淘汰的过程，筛选出具有好的发育潜能的胚胎养成囊胚进行冷冻，而发育潜能差和染色质异常的胚胎被淘汰掉。影响可利用囊胚形成的因素有很多。前期研究结果显示，可利用囊胚的形成与女方年龄、D3胚胎均一性、D3细胞数和D3胚胎碎片密切相关，D3细胞数≤6的可利用囊胚形成率为24.41%[10]。尽管4～5-细胞胚胎延长体外培养形成的囊胚具有较高的着床率、临床妊娠率和分娩率，但是体外囊胚培养有风险，可能会导致没有可利用的囊胚形成。因此，若患者不同意囊胚培养或者授精第3天只有4～5-细胞胚胎，也可以将4～5-细胞胚胎冷冻起来，建议再次促排累积胚胎以获得较好的临床结局。

综上所述，授精第3天4～5-细胞胚胎依然具有不同程度的发育潜能，是具有利用价值的。针对授精第3天4～5-细胞胚胎可以通过新鲜周期行囊胚培养冷冻复苏，或者再次促排累积胚胎以获得较好的临床结局。