miR-106b通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对Hcy诱导的VSMCs细胞增殖和迁移的影响

动脉粥样硬化是心脑血管疾病最常见的病因之一，是中风、心肌梗死、不稳定心绞痛和心脏性猝死的潜在原因，是一种动脉壁的慢性炎症疾病，主要累及大中型动脉，尤其是血管分支和管腔迂曲明显的部位，动脉急性闭塞所致的心肌梗死和脑卒中是最重要的并发症[1]。过度饮酒、吸烟、饮食不规律、长期缺乏运动、肥胖可促进心脑血管疾病的发生和发展，引起过早死亡[2]。血管平滑肌细胞（vascular smooth cells，VSMCs）是动脉壁的主要成分之一，研究证明VSMCs 的异常增殖和迁移是动脉粥样硬化发生发展中重要的病理生理基础，在动脉粥样硬化斑块的形成和最终破裂中起着关键作 用[3～5]。所以寻找针对VSMCs 功能的策略对动脉粥样硬化治疗具有重要意义[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是22nt 左右的非编码RNA，其通过抑制靶基因的翻译或者降解mRNA 来调控基因的表达，从而对多种疾病的发生和发展产生影响[6～8]。研究证实，miR-106b 在心脑血管疾病[9]、子宫内膜癌[10]、慢性淋巴细胞白血病[11]、肝癌[12]等多种疾病中发挥重要作用。戴冬伟等[13]研究显示，miR-106b 在烟雾病患者血清中呈高表达，mTOR 信号通路与烟雾病发病可能相关。Zhang 等[9]研究显示，上调miR-106b 可抑制动脉粥样硬化内皮细胞凋亡。Liu等[14]研究表明，重复性磁刺激可以调控miR-106b表达，刺激神经祖细胞的增殖。研究发现miR-106b 是一个评估癫痫的生物标志物[15]。本研究分析动脉粥样硬化中miR-106b 的表达量，探讨其通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路对Hcy 诱导的VSMCs细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 收集我院2019年6～12月诊断为动脉粥样硬化42 例患者的血清（患病组）及25 例健康志愿者血清作为对照（对照组），参考相关诊断标准[2]，患病组为临床动脉粥样硬化患者，其冠状动脉直径较原动脉管径或相邻节段管径≥1.5 倍，且未定位（＞20mm 长和/或包括动脉长度的1/3 以上）。患者及家属均签署知情同意书，本研究获医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂 miR-106b mimics、miR-NC 均购自上海吉玛制药技术有限公司；GAPDH 抗体购于Cell Signaling Technology 公司；逆转录试剂盒Prime Script RT Rea-gent Kit、PCR 试剂盒SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit 购于TaRaKa 公司；VSMCs 细胞购自上海生物化学细胞生物学研究所；细胞和蛋白提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 等抗体购自Abcom 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染 参考相关操作[2，9]，细胞在37℃、5%CO2含10%FBS、100U/ml 青霉素、100mg/ml 链霉素的DMEM 培养基中培养。分为4 组，未加任何处理为Control 组，加入1mmol/L Hcy 为Hcy 组，转 染miR-NC 为Hcy+miR-NC 组，转 染miR-106b mimics 为Hcy+miR-106b mimics 组。根据Lipofecta- mine 2000 说明书操作。

1.2.2 qRT-PCR 检测 提取细胞系的总RNA，操作步骤严格按照说明书进行。按照逆转录酶试剂盒说明书指导进行逆转录反应，得到cDNA，按照SYBR Prime Script miRNA RT-PCR 试剂盒说明，使用ABI Prism 7500 PCR 进行RNA 水平的测定。miR-106b上游引物序列为5'-TGCGGCAACACCAGTCGATGG -3'，下游引物序列为5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGG T-3'；GAPDH 上游引物序列为5'-TTGGTATCGTGG AAGGACTCA-3'，下游引物序列为5'-TGCGGCAA- 3'。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.3 MTT 实验 在细胞计数后，进行细胞培养24h，制备细胞悬液，选取0.1ml/孔细胞悬液接种于96 孔板，每培养24h 后，加入MTT 试剂，570nm 处测量吸光值。实验重复3 次。

1.2.4 Wound healing 实验 把细胞接种到6 孔板中， 5%CO2孵育过夜，首先用记号笔在每孔的背面做好标记，以确定位置，用PBS 缓冲液冲洗细胞孔，把悬浮细胞去除，加入培养基后，5%CO2孵育。显微镜下拍照，测量划痕的距离并记录，实验重复3 次。

1.2.5 Western blot 检测 制备蛋白样本，SDS-PAGE电泳，结束后进行转膜操作，将凝胶中的目的蛋白转移到PVDF 膜上。用PBS 缓冲液冲洗PVDF 膜，分别进行一抗孵育，再用PBS 缓冲液洗涤3 次，每次2min，进行二抗孵育，再充分洗涤3 次，每次2min，进行显色，计算蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0 统计软件进行分析，计量资料用±s表示，采用t检验比较及单因素方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-106b 在动脉粥样硬化患者血清和细胞中的表达qRT-PCR 检测结果显示，与对照组相比，miR-106b 在动脉粥样硬化患者血清中呈低表达（P＜0.01），见图1；同时，miR-106b 在Hcy（1mmol/L） 诱导的VSMCs 中表达下调，而在转染miR-106b 的VSMCs 中呈高表达（P＜0.01），见图2。

2.2 miR-106b 对VSMCs 细胞增殖和迁移的影响MTT 实验结果显示，适当浓度Hcy 能够诱导VSMCs的增殖活力；与转染miR-NC 相比，转染miR-106b mimics 细胞的增殖能力显著被抑制（P＜0.05），见图3；同时，Wound healing 实验表明通过转染miR-106b mimics 过表达细胞迁移率降低，细胞的迁移能力受到抑制（P＜0.05），见图4。

2.3 miR-106b 对PI3K/Akt/mTOR 信号通路的影响Western blot 结果显示，Hcy 可以增加PI3K、Akt 和mTOR 蛋白含量；同时，与miR-NC 比较，PI3K、Akt、mTOR 表达量在转染miR-106b mimics 的Hcy 诱导VSMCs 细胞中明显下调（P＜0.05），见图5。

图1 qRT-PCR 检测患病组和对照组血清样本中 miR-106b 相对表达量

图2 qRT-PCR 检测不同细胞中miR-106b 相对表达量

图3 MTT 检测不同细胞的增殖情况

图4 Wound healing 检测不同细胞的迁移情况

图5 Western blot 检测PI3K/Akt/mTOR 蛋白的表达情况

3 讨论

动脉粥样硬化在心血管疾病中最常见，该疾病涉及多种细胞因子参与，与脂质代谢、内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞活动及血小板活化有关。其中VSMCs 的增殖、迁移及侵袭是动脉粥样硬化发生的必要条件，活化VSMCs 促进动脉粥样硬化斑块的进展和最终的破裂[16]。所以迫切需要有效的治疗靶点来降低动脉粥样硬化的发生率。有研究显示[17]，miRNA 可能通过促进相关靶mRNA 的降解及（或）抑制翻译在转录后水平调节细胞的侵袭与转移过程。因此，本研究探讨miR-106b 在动脉粥样硬化患者中的表达及其通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路对VSMCs 细胞增殖和迁移的影响。

microRNA 在转录后水平调控基因的表达，其在包含心脑血管疾病等多种疾病的发生和发展中起着至关重要的作用。研究表明，多种microRNA在心脑血管疾病中扮演着重要角色，包括miR-590、miR-98、miR-22、miR-365、miR-let-7c 等[17，18]。 miR-106b 与多种疾病的发生相关，包括卵巢癌、癫痫、阿尔兹海默症等。低表达miR-106b 可以作为阿尔兹海默症的潜在标志物。miR-106b 上调可抑制ox-LDL 诱导的动脉粥样硬化内皮细胞凋亡。本研究结果显示，miR-106b 在动脉粥样硬化患者血清和Hcy 诱导的VSMCs 细胞中呈低表达，且转染miR-106b mimics 后，Hcy 诱导的VSMCs 细胞增殖及迁移能力均显著受到抑制，提示miR-106b 在动脉粥样硬化中可能扮演抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR 信号通路在细胞分化、生长中广泛参与，是重要的调控因子，研究证实该通路与动脉粥样硬化疾病密切相关[19，20]。研究表明，Akt/mTOR 信号通路的选择性抑制可通过激活巨噬细胞抑制动脉粥样硬化的进展，提高动脉粥样硬化斑块的稳定性[21]。LncRNA ENST00113 在动脉粥样硬化中通过激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路实现抑制增殖、迁移。在动脉粥样硬化中氧化性低密度脂蛋白通过PI3K/Akt 激活mTOR，是平滑肌细胞增殖所必须的。本研究通过分析miR-106b 在动脉粥样硬化中的表达，观察其对PI3K/Akt/mTOR 信号通路的影响，结果显示，与miR-NC 比较，PI3K、Akt、mTOR 表达量在转染miR106b mimics 的Hcy 诱导VSMCs 中下调，证明Hcy 诱导的VSMCs 细胞增殖及侵袭可能与PI3K/Akt/mTOR 通路相关。

综上所述，miR-106b 在动脉粥样硬化中呈低表达，并且通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路抑制Hcy诱导的VSMCs 细胞增殖和迁移。本研究结果为后续相关机制研究提供参考，为治疗动脉粥样硬化提供了一个可能的潜在靶点。