三株优良促生菌的１６ＳｒＤＮＡ序列初探

李显刚　姚拓　舒键虹　高巍

摘要：百脉根根际分离出根瘤菌2株（LC15、LC20）与白三叶根际中分离出根瘤菌RW183基因组DNA经PCR扩增16S rDNA序列、阳性克隆检测、质粒提取测序，并与GenBank中已知序列比对，结果表明，菌株LC15与LC20的16S rDNA序列与多株克雷氏菌属（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超过99.00%，RW18与勒克氏菌属中的Leclercia adecarboxylata（HQ242722）核苷酸序列同源性为99.79%，结合各菌株的主要生理生化特征，将菌株LC15与LC20初步鉴定为Klebsiella sp.，将菌株RW18鉴定为Leclercia sp.。

关键词：促生菌;16S rDNA序列;豆科牧草;百脉根;白三叶

中图分类号：S541;Q785        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2020）06-0005-03

随着农牧业和园林绿化（包括草坪业）的发展，以新型肥源替代部分化肥的应用成为生态农牧业发展的必然趋势，百脉根和白三叶得到更多、更广的应用。本研究从生长在贵州黔南地区的百脉根根际分离出根瘤菌2株（LC15与LC20），白三叶根际中分离出根瘤菌1株（RW18），均具有溶解多种难溶磷源及分泌植物生长激素（IAA）的功能，并对其部分生物学特征了进行了初步研究，采用16S rDNA分子生物学技术，对3菌株的基因序列、系统发育学和分类地位进行分析，旨在为进一步提高喀斯特地区土壤中磷素的循环利用提供基础，为开发利用百脉根及白三叶根际溶磷微生物资源及其绿色无公害生产提供促生菌菌种资源。

1  菌株菌落特征观察及主要生理生化特征测定

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[1]对菌株菌落形态特征（菌落质地、形状和大小、边缘、表面、隆起形状，透明度、生长速度等）、主要生理生化特征[葡萄糖利用、甘露醇利用、麦芽糖利用、果糖利用、淀粉水解试验、柠檬酸盐试验、过氧化氢酶试验、吲哚试验、二乙酰（V-P）试验、硫化氢试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、甲基红（M-R）试验等]进行试验和观察记录。具体方法见文献[2]。

1.1  细菌总DNA提取

将供试菌株用LB培养基培养活化并检查纯度后，采用宝生物（大连）公司提供的细菌DNA基因组提取试剂盒提取菌株基因组DNA。

1.2  16S rDNA的PCR扩增

将提取的菌株基因组DNA稀释至20 ng/μL，并以此浓度的细菌总DNA为模板，扩增16S rDNA。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

正向引物：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。

PCR扩增体系为25 μL，以灭菌的ddH20代替模板DNA作为阴性对照，反应体系组成如下：10×buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物（10 μmol/L）1.0 μL，模板1.0 μL（20 ng/μL），Taq DNA Polymeras 0.25 μL，ddH20 17.25 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，循环30次，25 ℃ 2 min。然后将PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3  PCR扩增产物的回收与检测

PCR扩增产物经凝胶电泳检测后，利用OMEGA BIO-TEK公司提供的Get Extraction Kit（50）D-2500-01试剂盒进行产物回收，回收产物再次经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4  PCR产物的回收连接转化

取1.0 μL PCR产物与克隆载体pMD 18-T Vector连接，5 μL连接反应体系中含有pMD 18-T Vector 0.5 μL、Ligation solution 2.5 μL、PCR扩增产物1.0 μL、无菌ddH20 1.0 μL。充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16 ℃水浴16～18 h。将连接产物转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，涂平板，待菌液吸干后，于37 ℃培养箱倒置培养12～16 h，随机挑取白色单菌落至含有Amp 50 mg/L的LB液体培养基中，37 ℃，200～300 r/min振荡培养过夜，然后以1 μL菌液为模板进行PCR扩增反应，反应条件同“1.2”，并取1 mL培养物用于质粒抽提，然后进行PCR鉴定。

1.5  16S rDNA序列测定、分析及系统发育树的构建

将菌株质粒产物送交上海生工进行测序。测序结果用DNAMAN軟件进行序列拼接，测序结果提交GenBank中的Blast数据库进行同源性比对，经Clustal（1.8）软件进行多重序列比较后，结合菌株的生理生化特征，用Mega2.0软件中的邻位相连法（Neighbor-jioning）构建菌株系统进化树。

2  结果与分析

2.1  菌株的菌落及生理生化特征

试验对LC15、LC20、RW183菌株进行了生理生化特征初步鉴定。3株菌在LB固体培养基上生长3 d后菌落特征为：菌株LC15菌落大、不规则，菌落颜色为淡白色，不透明，湿润，菌落中间凸起，边缘光滑;菌株LC20菌落大，不规则，菌落颜色为乳白色，边缘不整齐、光滑，半透明，湿润，菌落中间凸起;菌株RW18菌落小，不规则，菌落边缘淡白色，中间淡黄色、凸起，菌落湿润、不透明。

3株菌的主要生理生化特征见表1。由表1可知，菌株LC15及LC20的吲哚试验、苯丙氨酸脱氨酶试验及明胶液化试验结果呈阴性，淀粉水解、柠檬酸盐利用、过氧化氢酶产气、二乙酰（V-P）与硫化氢变色及硝酸盐还原试验结果呈阳性;菌株RW18不利用柠檬酸钠、吲哚及苯丙氨酸脱氨酶，试验不变色，且不能使明胶发生液化，但能使淀粉水解、过氧化氢酶产气、硝酸盐还原，二乙酰（V-P）及硫化氢试验呈阳性。

2.2  PCR产物电泳及其产物回收

对各菌株在LB液体培养基中培养24 h的菌体进行收集，并提取总DNA，将各菌株基因组DNA稀释到20 ng/μL，并以此为模板进行PCR扩增，其扩增产物电泳见图1。各菌株DNA PCR扩增条带明亮，无杂带，片段长度约为1 500 bp，与16S rDNA序列分析方法片段大小一致。将各菌株DNA PCR扩增产物进行回收，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，回收产物无杂带，明亮。

2.3  DNA PCR扩增产物的转化及质粒提取

将菌株DNA的PCR扩增回收产物进行阳性克隆，在每个菌株的蓝白斑平板上随机挑取5个白色菌落进行液体培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增，检测是否成功克隆转化子。各菌株转化子菌落电泳见图2。由图2可知，各菌株转化子均扩增得到约1 500 bp的条带，均为阳性克隆。对阳性克隆进行重组质粒DNA提取，以重组质粒DNA为模板进行PCR扩增，其电泳见图2。由图2可知，在约1 500 bp处扩增出特异性明亮条带，初步说明各菌株的16S rDNA序列已成功插入pMD18载体上。

2.4  菌株序列分析

将各菌株的重组质粒DNA送交上海生物工程公司进行测序，测序结果表明，菌株LC15的目的基因长度为1 441 bp，菌株LC20的目的基因长度为1 429 bp，菌株RW18为1 430 bp。3菌株的目的基因长度接近16S rDNA基因片段的长度，符合试验目的。采用BLAST程序对3菌株的16S rDNA序列与GanBank中已登录细菌的16S rDNA序列进行同源性比较，结果发现，菌株LC15与LC20的16S rDNA序列于多株克雷氏菌属（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超过99.00%，其中菌株LC15、LC20分別与Klebsiella pneumoniae strain 26（HQ259959）、Klebsiella variicola strain7（HQ259961）的同源性高达99.51%和99.93%;菌株RW18与勒克氏菌属中Leclercia adecarboxylata（HQ242722）的核苷酸序列同源性为99.79%。菌株LC15与LC20的相似性达到99.37%。

依据上述比对结果及各菌株的主要生理生化特征，将菌株LC15与LC20初步归属为克雷氏菌属（Klebsiella sp.）细菌;将菌株RW18归属为勒克氏菌属（Leclercia sp.）。菌株LC15、LC20与RW18的16S rDNA序列同源性系统进化树见图3。

3  讨论

促生菌接种于农牧作物具有重要作用，例如韩文星[3]、叶喜文等[4，5]、Hariprased等[6]及朱培淼等[7]以溶磷菌为主的PGPR促生菌接种到各试验材料后的结果表明，作物鲜重、干重、株高、根长、叶绿素含量、穗长、有效分蘖数以及吸收磷量和根际土壤有效磷含量均较对照或单施N、P、K有不同程度的增加;沈德龙等[8]从水稻中分离的成团肠杆菌YA19可分泌4种生长激素，其中的分裂素包括玉米素核苷、二氢玉米素核苷及异戊烯腺嘌呤;由芽孢杆菌组成的复合解磷菌剂广泛用于水稻、豌豆等多种农作物及牧草上，对发挥解磷功能和提高农牧作物产量具有很好的效果[9];王炜等[10]研究复合菌肥对油菜生长的影响结果表明，其鲜重、叶绿素a及叶绿素b均随复合菌肥用量的增加而升高;牛廷香等[11]将溶磷菌嫁接到柑桔幼苗后，对改善植株磷素营养和促进苗木生长均有明显作用。此外，胡晓峰等[12]分离到的一株溶磷细菌，对辣椒疫霉、大丽轮枝菌、烟草疫霉烟草变种和立枯丝核菌有拮抗作用。因此，鉴定本研究中的3株优良菌株意义重大，为后期研究3株菌株对农牧作物的相关作用奠定基础。

随着现代科学技术的不断发展，人类对微观世界的认识也在不断深入。特别是现代分子生物学的迅速发展，使得细菌的分类与鉴定更为科学。目前，对细菌的鉴定方法较多，如16S rDNA序列分析、PCR技术、质粒图谱分析法、化学分类鉴定法及核酸杂交技术等。本研究采用16S rDNA序列分析法对3株溶磷菌进行了初步鉴定，并初步确定了菌株LC15与LC20为克雷氏菌属（Klebsiella sp.）细菌，菌株RW18为勒克氏菌属（Leclercia sp.）细菌，由于未对这3株菌的微观形态和革兰氏染色等进行观察，所用鉴定方法单一，未鉴定到种。

参考文献：

[1] 中国科学院微生物研究所.伯杰氏细菌鉴定手册[M].第九版.北京：科学出版社，1994.

[2] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[3] 韩文星，姚  拓，席琳乔，等.PGPR菌肥制作及其对燕麦生长和品质影响的研究[J].草业学报，2008，17（2）：75-84.

[4] 叶喜文，焦  峰，吴金花，等.PGPR促生菌肥在水稻上应用效果研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2005，17（1）：9-11.

[5] 张  堃，张德罡，姚  拓，等.PGPR菌肥制作及其对高寒牧区3种禾本科牧草苗期株高的影响[J].草原与草坪，2006（3）：49-52.

[6] HARIPRASED P，NIRANJANA S R. Isolation and characterization of phosphate solubilizing rhisobacteria to improve plant health of tomato[J].Plant Soil，2009，316：13-24.

[7] 朱培淼，杨兴明，徐阳春，等.高效解磷细菌的筛选及其对玉米苗期生长的促进作用[J].应用生态学报，2007，18（1）：107-112.

[8] 沈德龍，冯永君，宋  未.成团肠杆菌的生物功能多样性及其分类最新进展[J].微生物学杂志，2002，22（1）：40-42.

[9] BECKIE H J，MOULIN A P，GLEDDIE S C.Response of alfalfa to inoculation with Penicillium bilaji[J]. Canadian journal of plant science，1998，78（1）：91-102.

[10] 王  炜，咸拴狮.复合菌肥对锌污染土壤中油菜生长的影响[J].山西农业科学，2008，36（1）：73-75.

[11] 牛廷香，邓  烈，易时来，等.溶磷菌对柑桔嫁接苗磷素营养及生长发育的影响[J].中国南方果树.2011，40（3）：11-14.

[12] 胡晓峰，郭晋云，张  楠.一株溶磷抑病细菌的筛选及其溶磷特性[J].中国农业科学，2010，43（11）：2253-2260.

收稿日期：2020-04-10

基金项目：国家自然科学基金项目（30960265）;贵州省农业攻关项目[黔科合NY（2009）3067]

作者简介：李显刚（1983-），男，贵州遵义人，畜牧师，硕士，主要从事草原监测监管及草地微生物资源与生态研究方面的工作，（电话）13595404735

（电子信箱）578912809@qq.com;通信作者，姚  拓（1968-），男，甘肃靖远人，教授，博士，主要从事草业科学（草地微生物和草地保护）

教学及研究工作，（电话）15002623079。