新疆石河子地区某牧场致奶牛乳房炎大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

马博，卜三平，刘鸽

（1.巴音郭楞职业技术学院，库尔勒 841000；2.新疆维吾尔自治区畜牧总站，乌鲁木齐 830000）

奶牛乳房炎与蹄病、酮病并称为奶牛场三大常见疾病[1～5]，而乳房炎是危害奶牛场发展的三大疾病之首。奶牛乳房炎给奶牛场的生产工作带来严重影响，并存在危害人们健康的危险，防治奶牛乳房炎是一项非常重要的工作。引起奶牛乳房炎的原因是多方面的[6～12]，其中病原微生物感染是主要原因[13]，引发奶牛乳房炎的主要致病菌有两类：一类是接触传染性致病菌，主要包括链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体、牛棒状杆菌等[14]；一类是环境性病原菌，主要是一些革兰氏阴性菌，如大肠埃希杆菌、肠道杆菌、停乳链球菌、粪肠球菌等[15]。引起奶牛乳房炎的致病菌有上百种，其中最常见的是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌[16]。本试验主要对从某规模化奶牛场采集的乳样进行了大肠杆菌的分离鉴定，目的是为后续治疗试验做好准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

在新疆石河子地区的某规模化奶牛场进行了乳房炎流行病学调查，调查发现部分临床型乳房炎奶牛和隐性乳房炎奶牛，选择12头临床型乳房炎奶牛的20个患乳区乳样和12头隐性乳房炎奶牛的16个患乳区乳样进行细菌分离与鉴定。

1.1.2 主要试剂

琼脂糖、革兰氏快速染色液、Taq DNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker（购自TaKaRa有限公司，大连)；细菌基因组DNA提取试剂盒（引物由北京睿博兴科生物技术有限公司完成）；强力霉素（DO）、青霉素（P）、林可霉素（CD）、阿洛西林（AZL）、杆菌肽（B）、红霉素（E）、氟苯尼考（FFC）、优立新（SAM）、头孢曲松（CTRX）、新霉素（N）、先锋霉素（KZ）、氨苄青霉素（AMP）、阿莫西林（AMC）、庆大霉素（CN）、链霉素（STR）、阿米卡星（AMK）、恩诺沙星（ENR）、氯霉素（C）、复方新诺明（SXT）、呋喃唑酮（F）共20种药敏纸片。

麦康凯琼脂（MAC，北京奥博生物）、胰蛋白胨（北京奥博生物）、营养琼脂（NA，实验室配置）、伊红美蓝琼脂（EMB，实验室配置）、酵母浸粉（上海蓝季科技），LB液体培养基、LB固体培养基、邓亨氏水按照实验室常规配置。大肠杆菌生化鉴定培养基（如蔗糖培养基）、三糖铁、柠檬酸盐、甘露醇、吲哚、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、M.R、V-P，均按照实验室培养基的常用方法进行配置[17]。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的富集、分离和纯化

首先，将36份乳样进行待分离细菌的富集，用接种环蘸取乳样到普通营养肉汤培养基中，置于37℃震荡培养12h左右。从摇床上取出试管进行观察，看到普通营养肉汤培养基由清亮变浑浊后，在麦康凯培养基上进行划线培养，置于37℃的恒温箱中。在麦康凯培养基上挑取单个典型红色菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检，观察菌体的染色特性和形态。在伊红美蓝培养基上进行划线培养，置于37℃的恒温箱中培养，然后进行鉴定。

1.2.2 大肠杆菌的生化鉴定

分别在三糖铁、柠檬酸盐、M.R、V-P、吲哚、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖培养基上进行接种，在37℃恒温培养箱中连续培养12～48h，观察试验结果，并做好相关试验记录。

1.2.3 分离菌株的16S rRNA鉴定

参照文献[18]合成16S rRNA PCR扩增引物。上游引物：5’-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3’；下游引物：5’-TCATCCTCTCAGACCAGCTA-3’（北京睿博兴科生物技术有限公司合成，特异性鉴定引物）。

按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）操作步骤提取大肠杆菌菌株的基因组DNA。

用基因组DNA为模板扩增16S rRNA基因，PCR法采用20μL反应体系：ddH2O 9μL，PCR Mix 8μL，模板2μL，上、下游引物均0.5μL。反应条件：95℃ 预变性4min，95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。观察目的条带的电泳图像。

1.2.4 耐药性敏感试验

在普通营养琼脂培养基上加50μL已经培养好的菌液，用“L”棒涂匀，菌液干燥后，在平板上贴5片不同的药敏纸片（要分布均匀，以免影响实验），纸片的制作标准参照NCCLS（美国国家临床试验室标准化委员会）；试验方法参考《兽医微生物学》[19]，放置温箱培养20h左右测量抑菌环直径，根据抑菌圈的大小来判断该株菌对抗菌药的敏感性[20]。

2 试验结果

2.1 大肠杆菌的分离与鉴定

分离菌株在麦康凯培养基上划线，放37℃恒温培养18h左右后观察培养试验结果，菌株在麦康凯培养基上形成大肠杆菌典型的形态特征：圆形、红色、表面光滑、隆起、湿润、菌落周边成淡淡的白色云雾状，直径大小为1.0～2.5mm的菌落（图1）；把分离到的细菌进行涂片、革兰氏染色、镜检，可见红色、革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌（图2）；分离到的细菌在伊红美蓝培养基上培养后形成圆形、隆起、表面光滑、带有金属光泽的菌落，测量其直径为1.0～2.0mm（图3）。统计试验结果，患奶牛乳房炎乳样中分离到20株疑似大肠杆菌。

图1 分离菌在麦康凯培养基上生长情况

图2 显微镜观察结果

2.2 生化鉴定结果

分离的细菌可在三糖铁斜面上产酸（斜面变黄）、产气、不产生H2S，均可以发酵麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖，而有3株不能分解蔗糖；M.R反应试验为红色，判为阳性；V-P反应试验阴性；吲哚反应试验呈红色，判为阳性；柠檬酸盐反应试验阴性。根据细菌鉴定方法，对分离细菌的生化鉴定结果符合有关大肠杆菌的生化特性[21]。

2.3 分离株的16S rRNA鉴定

对该20株奶牛乳房炎大肠杆菌分离株采用特异性引物扩增后，均得到了与预期目的片段大小一致的条带（202 bp），见图4、图5。

图4 大肠杆菌16S rRNA PCR鉴定

图5 大肠杆菌16S rRNA PCR鉴定

2.4 耐药性试验结果

根据药敏试验发现，从石河子地区某规模化奶牛场得到的20株大肠杆菌对各抗菌药的耐药性差异很大，从0.00%～100.00%不等；对强力霉素（DO）、青霉素（P）、林可霉素（CD）、阿洛西林（AZL）、杆菌肽（B）、红霉素（E）的耐药率均高于50%，对阿洛西林（AZL）的耐药率则高达90.00%，而对红霉素（E）、青霉素（P）的耐药率分别为95.00%和90.00%，对林可霉素（CD）、杆菌肽（B）的耐药率甚至可达到了100%，而分离菌株对氟苯尼考（FFC）、优立新（SAM）、头孢曲松（CTRX）三种药物都有较好的敏感性，大多数菌株对新霉素（N）表现为既不耐受也不敏感（表1）。

表1 20种抗菌药物对20株大肠杆菌耐药性试验结果

表2 20株大肠杆菌多重耐药型分析结果

3 讨论与分析

经对采集的乳样进行分离鉴定，本试验共分离出20株菌株，通过形态学特征观察、生化特性鉴定、16S rRNA鉴定，最终确定20株分离菌均为大肠杆菌。

大肠杆菌性乳房炎早在1896年就有报道，其是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一，将分离的大肠杆菌涂片，革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性、粗短、两端钝圆的小杆菌。常见的大肠杆菌血清型有O2、O8、O21、O81、O86。

大肠杆菌常被称为“条件性致病菌”，引起大肠杆菌性乳房炎的原因是多方面的，如牛舍环境、挤奶操作、遗传等。牛舍中的粪污应及时清理，尽量保持牛舍的通风干燥，避免环境中的大肠杆菌对奶牛乳房的威胁；挤奶操作要严格规范，做好挤奶前后乳房的消毒工作，避免机械设备损伤乳房。奶牛源大肠杆菌的血清型是比较复杂的，常具有地域性的不同差异，并且大肠杆菌引起奶牛乳房炎的发病率有上升趋势。奶牛乳房感染大肠杆菌的原因主要是饲养环境差和奶牛自身的抵抗力下降。致病性大肠杆菌侵入机体乳汁、血液和淋巴液而引起的乳房组织炎症反应，常呈急性经过，并且多见于高产奶牛及产后泌乳高峰期。

20世纪40年代，抗生素被发现，并逐渐得到广泛应用，在过去的几十年中对奶牛乳房炎的治疗起到了非常重要的作用。20世纪末至今，食品安全问题备受大家关注，也曾出现过诸多食品安全事件，其中不少是出现在畜牧生产环节的。我国加入WTO以后，食品安全问题更被提升到了另一个新的高度。

目前，抗生素疗法仍在奶牛乳房炎治疗中起主导作用。然而，不合理使用抗生素会带来新的更为严重的问题：致病菌的耐药性不断增强，耐药谱也变广[22]。通过本试验分离的20株大肠杆菌对20种抗生素的药敏试验发现，该20株大肠杆菌对其中的绝大多数抗生素均产生了耐药性，而对林可霉素、杆菌肽、青霉素及红霉素的耐药性尤高。这提示我们，在牛场的用药中要选择敏感的药物，如氟苯尼考（FFC）、优立新（SAM）、头孢曲松（CTRX），且要交替使用，以免细菌对某一类抗生素产生耐药性。倪春霞等在2010年也报道过川、甘、蒙3省区致奶牛乳房炎大肠杆菌对大环内酯类抗生素严重耐药，对喹诺酮类抗生素高度敏感[23]；Sumathi等在2008年报道奶牛源大肠杆菌可对新霉素、氨苄西林产生耐药性[24]。徐继英等在2012年对国内7个省份的部分地区的奶牛乳源大肠杆菌进行了耐药性分析，该研究与石河子地区的大肠杆菌对复方新诺明和阿莫西林耐药性上存在一定差异[25]；姚伟等在2016年对辽宁地区规模奶牛场乳房炎大肠杆菌的药物敏感性测试的结果显示，试验的大肠杆菌分离株对磺胺类药物、氯霉素类药物表现出高耐药性，对磺胺二甲氧嘧啶的耐药率高达80%[26]；武军元等[27]在2017年对新疆阿克苏地区分离的大肠杆菌进行耐药性分析发现，分离株对氨苄西林的耐药性最高，耐药率为50%，对多西环素、四环素和链霉素的耐药性次之，耐药率为40%，这说明不同地区大肠杆菌的耐药性存在一定差异，可能与抗生素的使用种类、频率等有一定关系。更多试验研究发现，奶牛乳房炎大肠杆菌对多种药物已经产生了严重的耐药性，这种现象的出现与抗菌药物的长期或频繁使用有重要关系[28]。

本试验从36份乳房炎乳样中分离到20株大肠杆菌，分离率高达55.56%（20/36），与姚伟等[29]对辽宁某规模化奶牛场进行的大肠杆菌性乳房炎流行病学调查结果（58.7%）相似。通过国内外有关大肠杆菌引起奶牛乳房炎的报道，可以得知大肠杆菌性乳房炎在全球普遍存在。从大肠杆菌分离情况看，该规模化奶牛场的奶牛乳房炎的致病菌中存在大肠杆菌，且感染率偏高。

大肠杆菌也是引起犊牛腹泻的一种比较常见的致病菌。从该奶牛场的犊牛养殖来看，犊牛腹泻比较普遍，也许与该奶牛场大肠杆菌乳房炎高发有一定的关系。建议及时预防大肠杆菌性乳房炎和犊牛腹泻，采取及时有效的措施，在使用抗生素防治大肠杆菌引起的疾病时，结合药敏试验结果严格遵守相关的用药规范[30]。