副干酪乳杆菌YLZB对小鼠免疫的调节作用

2020-09-02姜岩世张永祥刘利平贡秋卓玛王然王鹏杰

中国奶牛 2020年8期

姜岩世，张永祥，刘利平，贡秋卓玛，王然，王鹏杰

（1.西藏高原之宝牦牛乳业股份有限公司，拉萨 610000；2.三河福成生物科技有限公司，廊坊 065201；3.中国农业大学营养与健康系，北京 100083）

益生菌系指活的微生物，当摄取足够数量时，对宿主健康有益[1]。益生菌在机体健康和疾病防治中发挥重要作用，主要包括抵抗致病菌感染、预防和治疗炎症性肠病、缓解过敏反应、抵抗癌症等[2～4]，其益生作用主要是通过直接或者间接地调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统的活性来实现的[5]。

免疫调节活性是筛选和评价益生菌的重要标准[6]。评价益生菌对免疫的调节作用主要包括系统免疫和黏膜免疫[7]。系统免疫包括血清中细胞因子和免疫球蛋白的产生，血液淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞反应以及脾淋巴细胞刺激等[8]，已被广泛用于评价益生菌的免疫调节作用。益生菌调节免疫的能力具有菌株特异性。研究表明，植物乳杆菌CJLP133和CJLP243能够增强T淋巴细胞的增殖反应，而鼠李糖乳杆菌LGG、植物乳杆菌CJNR26和格氏乳杆菌CJMF3没有表现此种效果[9]。

本研究以分离自西藏牦牛乳的副干酪乳杆菌YLZB为研究对象，评价其对系统免疫的调节作用，为开发自主知识产权的益生菌相关产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种：副干酪乳杆菌YLZB，中国微生物菌种保藏中心保藏，CGMCC No.12939。

1.1.2 试验动物：Balb/C小鼠，雄性，体重18～22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.3 试剂：小鼠IgG ELISA试剂盒、小鼠LYZ ELISA试剂盒，购自美国GBD公司；NK细胞活性检测WST-8试剂盒，购自日本D0JINDO公司；Giemsa染料，购自美国Sigma公司，IgG ELISA试剂盒，武汉优尔生公司，其余试剂均为分析纯。

1.2 试验设备

酶标仪（Biotek, ELX808）；超净工作台（新加坡ESCO公司）；CP21GⅡ高速冷冻离心机（日立公司）；恒温培养箱（37℃、43℃）；G560E漩涡混合器（美国SCIENTIFIC Instruments公司）；HV-110高压灭菌锅（日本Hirayama公司）；Sartorius pH计（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验动物分组及处理

将8周龄Balb/C小鼠随机分为4组：空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组8只。空白对照组小鼠每只灌胃0.2mL生理盐水，低、中、高剂量组分别灌胃5×106、5×108和5×1010CFU/mL的副干酪乳杆菌YLZB 0.2mL，每日灌胃1次，连续30d，期间小鼠自由饮水和采食。

1.3.2 血清样本制备

小鼠处死前摘取眼球取血，血液样本在室温下放置2h，随后在4℃条件下1 000r/min离心10min，收集血清，-20℃保存待测。

1.3.3 脾淋巴细胞悬液制备

无菌去小鼠脾脏，置于200目金属筛网上，将筛网浸没在含有RPMI-1640培养基的培养皿中。用玻璃注射器内芯轻轻研磨脾组织，使其通过筛网，得到单细胞悬液。向单细胞悬液中添加1mL无菌水，轻晃20s以裂解其中的红细胞，加入2×Hank’s液，将出现的黄白色组织团块吸除，剩余细胞用RPMI-1640培养基洗涤两次后重悬于RPMI-1640培养基中，即得到脾淋巴细胞悬液。

1.3.4 脾淋巴细胞增殖能力检测

利用MTT试剂盒对淋巴细胞悬液进行测定，在490nm波长下检测吸光值。ConA（刀豆蛋白）孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。受试样品吸光值差值显著高于对照组（P＜0.05），判定阳性。

淋巴细胞转化值＝ConA刺激孔值-对照孔值

1.3.5 巨噬细胞吞噬能力测定

分离小鼠腹腔细胞液，将细胞液与1%鸡红细胞等体积混和，滴加至载玻片的封闭圈内，37℃培养20min，结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞和未被吞噬的鸡红细胞冲掉，加甲醇固定1min，姬姆萨原液染色15min，脱色液（甲醇20mL、蒸馏水80mL、2mol/L HCl 2滴）脱色，蒸馏水冲洗干净，晾干。用40×显微镜计数，吞噬率为每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分比。

1.3.6 NK细胞杀伤活性

脾脏分离出的NK细胞与YAC-1淋巴瘤细胞各100μL共同培养，利用WST-8试剂盒检测NK细胞活力。

受试样品的NK细胞活力显著高于对照（P＜0.05），判定阳性。

1.3.7 血清IgG浓度测定

根据ELISA试剂盒说明书检测IgG浓度。

1.3.8 统计学分析

利用SPSS17.0对结果进行统计学处理，结果以平均值±标准差表示，组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 淋巴细胞增殖能力

T细胞是获得性免疫中细胞免疫的重要效应细胞，脾淋巴细胞中的T细胞在ConA的刺激下增殖，增殖程度反映T细胞的活性[10]。淋巴细胞增殖能力结果如图1所示，以副干酪乳杆菌YLZB灌胃小鼠30d后，中、高两个剂量组小鼠的淋巴细胞增殖能力显著高于对照组，并呈剂量依赖性，表明副干酪乳杆菌YLZB可以显著促进脾淋巴细胞增殖。

图1 淋巴细胞增殖能力

2.2 巨噬细胞吞噬能力

巨噬细胞是先天免疫的重要效应细胞。当病原入侵时，机体做出早期的防御反应，通过计数巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率，可判断巨噬细胞的吞噬能力，反映机体非特异性免疫功能的强弱[11,12]。巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力如图2所示，以副干酪乳杆菌YLZB灌胃小鼠30d后，中、高两个剂量组小鼠的巨噬细胞吞噬能力显著高于对照组，并呈剂量依赖性，表明副干酪乳杆菌YLZB可以显著刺激小鼠的巨噬细胞吞噬活性。

图2 巨噬细胞吞噬能力

2.3 NK细胞杀伤能力

NK细胞是一种细胞毒淋巴细胞，能够识别和控制多种病原菌，在免疫自稳和免疫监视方面起突出作用[13]。NK细胞杀伤能力如图3所示，以副干酪乳杆菌YLZB灌胃小鼠30d后，低、中、高三个剂量组小鼠的NK细胞杀伤率能力显著高于对照组，并呈剂量依赖性，表明副干酪乳杆菌YLZB可以显著提高NK细胞的活性，从而提高机体抵御感染的能力。

图3 NK细胞杀伤能力

2.4 血清IgG浓度

血清IgG是在抗原提呈细胞识别抗原后，B细胞被活化并分化成抗体分泌型浆细胞时产生的，可用于反映菌株对机体体液免疫的影响[14,15]。小鼠血清IgG浓度如图4所示，随着副干酪乳杆菌YLZB剂量升高，血清IgG浓度相应增加，并呈剂量依赖性，表明副干酪乳杆菌YLZB能够增加小鼠IgG含量，从而提高机体抵抗感染的能力。