基于HPLC-ELSD法测定食醋中5种还原糖的含量

凌蕾 张季 向丽萍 王兰兰 骆书娜 王奥

摘 要：目的：建立一种同时测定食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的高效液相色谱法。方法：食醋样品经处理后，采用HPLC-ELSD，以果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖为对照品，固定相为Agilent ZORBAX NH2 （250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（70∶30）。结果：5种还原糖在色谱柱上得到有效的分离，在0.5～10.0 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率在97.19%～104.03%，相对标准偏差（RSD）为2.12%～3.27%。对两个不同企业赤水晒醋进行测定分析，结果显示不同企业以及不同年份的赤水晒醋中糖含量有较大的差异。结论：该方法结果准确，重现性好，适用于食醋中糖含量的测定。

关键词：高效液相色谱;蒸发光散射检测器;食醋;糖

Abstract：Objective： To establish a determination HPLC-ELSD method for the simultaneous analysis of fructose，glucose，sucrose， maltose and lactose in vinegar. Methods： Vinegar sample was pretreated and then determined by HPLC-ELSD. Fructose， glucose， sucrose， maltose and lactose as the standard substance， Agilent ZORBAX NH2 （250 mm×

4.6 mm， 5 μm） was adopted， the mobile phase was composed of acetonitrile-water （70∶30）. Results： Five sugars could be well separated， and have good linearity relationship in 0.5～10.0 mg·mL-1， the average recoveries were 97.19%～104.03%， and the RSD were 2.12%～3.27%. By measuring and analyzing of chishui sun vinegar samples from two different enterprises，the result showed that the content of sugar in chishui sun vinegar were different between different enterprises and years. Conclusion： The results showed that the method is simple，accurate and repeatable and it is suitable for the analysis of fructose， glucose， sucrose， maltose and lactose in vinegar.

Key words：HPLC; ELSD; Vinegar; Sugar

中图分类号：O657.72

食醋作为一种大众化的酸性调味品，具有助消化、抗衰老和润肤美容、抑制血糖升高、减少结石发生、抗癌等作用[1]。食醋有着悠久的制作工艺历史，传统食醋制作工艺主要以大米、糯米、高粱、玉米、小米和水果等为原料，经过发酵酿制而成。在酿造发酵过程中因有大量微生物参与，能够产生各种有机酸、还原糖、氨基酸、黄酮、多酚等多种营养成分，赋予食醋独特的保健功能并且影响食醋的风味、品质以及出醋率等[2]。食醋中糖主要来源于在生产过程中添加的蔗糖和生产原料的糖化。糖作为影响食醋风味重要的因素之一，是醋中甜味的重要来源，不仅能减轻酸带来的刺激，还能增加食醋的色泽和稠厚度[3]。

食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖属于还原糖，目前还原糖的测定方法主要包括高锰酸钾滴定法、斐林试剂滴定法、比色法等化学法，以及近红外吸收光谱快速测定法、高效液相色谱法等[4-5]。其中化学法不仅耗时长、操作复杂，还无法对其进行准确定性和定量分析。目前有文献报道高效液相色谱串联示差折光检测器应用于测定食醋中糖含量，但示差折光检测器有灵敏度较低、系统平衡时间较长等缺点，同时温度、流速、基线噪音等因素对目标化合物的分离影响较大[6]。而蒸发散射检测器（ELSD）测定食醋中糖含量的稳定性好、灵敏度比示差折光法有更高的优势，并且高效液相色谱串联蒸发光散射检测器对食醋中糖进行定性和定量的检测少有报道。因此，本文采用高效液相色谱串联蒸发光散射检测器，建立一种对食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖同时测定的高效液相色谱法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260高效液相色谱仪、1260蒸发光散射检测器（美国Agilent公司）、台式高速冷冻离心机（美国Sigma公司）、SEP-PARK C18固相萃取柱（美國沃特世公司）、Milli-Q超纯水系统（密理博中国有限公司）。

果糖（纯度>99.7%）、葡萄糖（纯度>99.4%）、蔗糖（纯度>99.9%）、麦芽糖（纯度>94.9%）、乳糖（纯度>94.8%），均购自Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈：色谱纯，购自美国天地公司;高纯氮气：纯度大于99.99%;食醋样品：市售。

1.2 样品前处理

1.2.1 样品预处理

准确移取食醋样品5 mL置于50 mL离心管中，加入20 mL去离子水，涡旋混合30 s，12 000 r·min-1离心5 min。取上清液5 mL，待净化。

1.2.2 净化

用5 mL甲醇和10 mL水活化C18固相萃取柱，取1.2.1项下5 mL上清液通过预先活化好的C18固相萃取柱净化，弃去初始的2 mL净化液，收集1.5 mL净化液，经0.45 μm微孔滤膜过滤至样品瓶，待测。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈∶水=70∶30;流速：1.0 mL·min-1;进样体积10 μL;色谱柱温度：35 ℃。

1.3.2 检测器条件

蒸发光散射检测器检测漂移管温度：40 ℃;载气流速：1.2 mL·min-1。

1.4 标准溶液制备

精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准品100.00 mg，用水溶解并定容至10 mL容量瓶中，配成浓度为10 mg·mL-1的混合标准品储备溶液。置于4 ℃保存，待用。

1.5 标准曲线绘制

精密量取不同体积的1.4项下混合对照品储备液置于10 mL容量瓶，用水定容至刻度，摇匀，配制成一系列的混合对照品溶液。依次按照1.3项下的分析条件进行测定，分别以果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的浓度（mg·mL-1）作为横坐标（X），测定的峰面积作为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的确定

以食醋样品为考察对象，对样品前处理方法进行探讨。由于食醋中含有蛋白质、色素、有机酸等营养物质，若采用直接稀释测定糖类成分有较大的干扰，并且容易对色谱柱造成损害[7]。因此，前期样品处理将这些杂质分离非常重要。

方法一，选择常用的蛋白质沉淀剂亚铁氰化钾和乙酸锌，根据文献中报道测定食品中糖含量的前处理方法，先加入亚铁氰化钾和乙酸锌沉降食醋中的蛋白质后，再根据色素、有机酸物质在C18柱上的保留时间长，而糖的保留时间短。将沉淀蛋白后的样品用SEP-PARK C18固相萃取柱分离[8-9]。本实验结果发现糖类物质通过该方法处理后受到抑制。

方法二，则根据1.2项下样品前处理方法进行，其中稀释倍数为4倍，前处理方法考察中发现当样品用水稀释2倍时杂质干扰太大，当稀释10倍或50倍时多数样品中糖的检测低于检出限。选择用4倍稀释后用SEP-PARK C18固相萃取柱净化。进样测定后分析，根据对照品图谱的保留时间确定食醋样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的组分，出峰时间分别为8.28、9.26、11.99、14.31 min和16.17 min。对照品及样品色谱图分别见图1、图2。结果发现该方法处理后样品能较好地去掉干扰杂质，并且操作过程简单。因此，该方法确定为本实验样品的前处理方法。

2.2 流动相的考察

本实验以乙腈和水为流动相，通过改变乙腈和水的混合比例，确定能分离5种对照品以及食醋样品中5种糖的最佳条件。分别考察了85∶15，80∶20，70∶30的等度洗脱条件以及初始流动相为80∶20梯度洗脱条件，发现梯度洗脱条件80∶30时5种糖的出峰时间均靠后并且不能完全分开。而等度洗脱条件中，以乙腈、水比例为70∶30时，出峰时间适合，且样品中5种糖能与杂质很好的分离。因此，最终选择的最佳流动相比例为乙腈∶水=70∶30的等度洗脱条件。

2.3 蒸发光散射检测器条件的考察

蒸发光散射检测器中载气流量和漂移管温度是影响化合物的基线噪音和灵敏度的两个重要因素。在乙腈∶水为70∶30，流速为1 mL·min-1的色谱条件下，对5种糖的混合标准溶液进行测定，通过调整载气流量分别为1.0、1.3、1.4 L·min-1和漂移管温度分别为30、40、50、60、70、70 ℃和80 ℃，最终确定灵敏度达到最高，基线稳定时的最佳条件载气流速为1.2 mL·min-1，漂移管温度为40 ℃。

2.4 线性关系及相关系数

在1.3的分析条件下，将配制好的系列对照品溶液分别测定并计算，回归方程及相关系数见表1。由表1可以看出，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的浓度与峰面积之间的线性关系均良好，且标准曲线的相关系数R2均在0.999以上，表明该标准曲线准确可信，5种糖的检测范围在0.5～10.0 mg·mL-1。

2.5 方法检出限

将果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的色谱峰高与基线信号之比接近3的浓度为最低检测浓度。本实验果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的检出限分别为15.00、7.00、8.00、10.00 mg·mL-1、和15.00 mg·mL-1。

2.6 精密度考察

将1.4项下混合对照品储备液稀释成浓度为10 mg·mL-1的溶液，经0.45 μm滤膜过滤，按照1.3项下的分析条件进行测定峰面积，连续进样6次。计算果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的相对标准偏差分别为2.7%、2.8%、3.95%、2.9%和3.95%。该实验结果表明仪器精密度良好。

2.7 重复性考察

取同一种食醋样品，按照1.2项下前处理方法，仪器重复测定6次，记录峰面积，蔗糖、麦芽糖和乳糖未检出。计算果糖、葡萄糖的相对标准偏差分别为1.2%、0.9%，表明该方法测定还原糖含量重复性良好。

2.8 回收率考察

取食醋样品5 mL（在现有定量限下进行测定，未检出蔗糖、麦芽糖和乳糖）共12份，每6份一组，分别精密加入高、低两种不同浓度的5种糖混合对照品溶液，按照1.2项下处理方法处理后，进行测定。结果见表2，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的平均回收率分别为104.03%、103.68%、97.19%、99.49%和99.48%。

注：ND表示含量低于方法检出限，下同。

2.9 食醋样品测定

赤水晒醋是一种受国家地理标志保护的产品，

1号和2～4号食醋样品分别来自两个赤水晒醋企业，不同生产企业，生产工艺略有不同[10-11]。利用该方法分别对两个不同企业的赤水晒醋糖含量进行测定，样品信息及测定结果见表3。结果表明，食醋中含糖的成分主要是果糖和葡萄糖，蔗糖和麦芽糖含量较少，4个样品中乳糖含量低于检测限。

3 结论

本实验采用HPLC-ELSD法同时测定食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖含量，灵敏度高，基线稳定，前处理方法简单，回收率大于90%，RSD小于5%，适用于食醋中5种糖类物质进行定性和定量分析。测定和分析两个不同企业的赤水晒醋，实验结果表明不同企业赤水晒醋含量有较大的差异，且食醋中的糖主要为果糖和葡萄糖。该方法操作简单，重现好，为众多企业生产和质检部门对食醋中糖含量的检测、应用和监管提供重要的技术支撑。

参考文献：

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基金项目：贵州省质量技术监督局科技计划项目“贵州地理标志产品赤水晒醋品质特征研究”（编号：2017kj010）;遵义市优秀青年科技创新人才培养项目“贵州省特色食品质量与安全研究及应用”（编号：遵优青科[2018]4号）;贵州省科技计划课题“贵州汇川城郊现代农业科技示范园区”（编号：黔科合平台人才[2016]5243-02号）。

作者简介：凌 蕾（1993—），女，硕士，工程师;研究方向为食品检测技术。

通信作者：王 奥（1986—），男，博士，高级工程师;研究方向为食品质量与安全风险。