清香型白酒发酵过程中微生物及理化指标的变化规律

贾丽艳 郭晋田 刘 帅 王晓勇 韩 英

（1 山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育创新中心 山西太谷030801 3 山西杏花村汾酒厂股份有限公司 山西汾阳032209）

清香型白酒是中国白酒主要的一支， 以高粱为原料， 大曲为发酵剂， 采用传统发酵工艺（图1），通过“清蒸二次清，地缸固态发酵，甑桶蒸馏”的方式生产而得[1]。其发酵工艺包括两次酒醅发酵过程，第1 次是以高粱为原料，添加大曲和水固态发酵，称为大楂发酵；第2 次是以第1 次发酵蒸馏后的基质为原料，添加大曲，固态发酵，称为二楂发酵。在生产中发现，大楂酒和二楂酒具有明显差异，如大楂酒醇正，二楂酒酸、酯香浓郁，其原因与发酵基质、微生物菌群结构及发酵环境分不开。

清香型白酒发酵过程是微生物适应环境生长代谢的过程。 发酵环境中理化指标会对酒醅中微生物的代谢生长产生影响， 微生物的代谢生长又影响微生物的菌群结果，从而影响白酒的风格。为此， 研究清香型白酒发酵过程中微生物菌群结构变化及理化指标的变化规律， 对于揭示其酿造机理具有重要意义。近几年，对于清香型白酒的研究较多， 主要集中于清香型白酒中微生物菌群结构及功能性菌株， 风味物质的产生对酒体风格的影响等方面。 对于清香型白酒酒醅发酵过程中理化指标或环境因素对清香型白酒的酿造微生物菌群的影响研究还较少。 大部分文献研究了清香型白酒一次酒醅发酵的菌群或环境中某个理化指标的变化规律及对白酒的影响。如李增胜等[2]分析了清香型白酒中包括多种微生物，如酵母菌、乳酸菌、红曲霉等，没有对其在酒醅如何发挥功能，影响白酒风味做进一步的阐述；曹云刚等[3]、刘坚等[4]仅研究了汾酒酒醅发酵某一阶段有机酸的变化规律；徐瑾等[5]运用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术研究了清香型白酒自然发酵过程中细菌群落结构的变化；雷震河等[6]利用高通量测序技术研究汾酒发酵过程中细菌群落结构的变化。

为此， 课题组以酿造清香型白酒的大楂和二楂酒醅为研究对象， 测定不同发酵阶段酒醅中微生物菌群、淀粉、还原性糖含量及理化指标，研究大楂和二楂发酵过程中微生物、 代谢物及理化指标动态变化规律， 为探明传统清香型白酒酿造机理及传统清香型白酒发酵的可调控化、机械化、自动化和智能化的发展提供一定的理论依据。

图1 传统清香型白酒酿造工艺流程Fig.1 The flowchart on the brewing process of the traditional mild flavour Baijiu

1 材料与方法

1.1 样品的采集

采样地点： 某清香型白酒厂实验分厂。

采样时间： 2015年5月份-6月份。

样品及编号： 大楂和二楂分别发酵0，3，7，10，15，21，23，28 d 的酒醅样品。 样品采集使用多点取样法，即在发酵缸表面的中央位置分别在上、中、下3 层3 个位点取等量酒醅样品，混合均匀，备用。

1.2 检测指标及测定方法

1）酸度的测定 采用酸碱滴定法，参考国标GB/T 5517-2010。

2）酒度的测定 采用酒精计法， 参考国标GB/T 10345-2007 酒精计法。

3）淀粉含量的测定 采用近红外检测技术[7]。

4）水分含量的测定 采用恒温干燥法， 参考国标GB4800-84。

5）pH 的测定 取5 g 酒醅， 加入45 mL 蒸馏水匀浆。 取样品40 mL，搅拌均匀后用pH 计测定。

6）还原性糖的测定 采用菲林试剂法， 参考国标GB/T 5009.41-2003。

7）温度的测定 采用纽扣温度计实时检测技术。

8）微生物的分离及计数 采用选择性培养基对霉菌、酵母、细菌进行分离及计数[8]。

2 结果与分析

2.1 酒醅发酵过程中微生物菌群的变化

通过倍比稀释平板培养计数法发现， 酒醅发酵过程中微生物菌群呈动态变化，且大楂、二楂菌群动态变化不同。 大楂发酵初期（1～3 d），菌数快速增殖，主要为细菌、酵母，能检测出少量霉菌；发酵3～7d，菌数相对稳定，主要为酵母和细菌，霉菌已检查不出，表明酒醅中霉菌没有生长，且大部分孢子在该环境下死亡； 发酵7～10 d， 菌数逐渐下降；15～28 d 出现细菌、酵母菌“二次生长”现象，其中细菌主要为乳酸菌。 二楂发酵过程中微生物生长趋势与大楂发酵过程相似却又不同， 表现为从二楂发酵开始分离不到霉菌， 究其原因可能是霉菌及其孢子对酸度敏感，二楂酒醅中pH 值偏低，抑制了孢子的萌发。总之，酵母菌和细菌是酒酿造过程中最活跃的功能菌群。 不同种属微生物出现在酿酒过程的不同时段，呈现出菌群“顺序消长，依次代谢”的特点。 王薇等[9]研究发现清香型白酒中酵母结构演替变化， 且大楂和二楂酒醅含有的优势酵母有所区别， 这可能是造成大楂酒和二楂酒差异的重要原因之一。此外，本研究发现酒醅发酵过程中乳酸菌发生动态变化， 发酵起始为乳球菌，发酵后期为乳杆菌，其原因可能是乳球菌需要的营养条件较乳杆菌低，且对酸、酒精的耐受性较低；乳杆菌的营养要求较高，且对酸、酒精具有一定的耐受性[10]。

2.2 发酵过程中温度的变化

由图2 可知，随着发酵的进行，大楂、二楂发酵温度逐渐升高，当发酵7 d 左右时，温度达到31℃左右，随后温度慢慢降落，15 d 后，温度缓缓降低到25 ℃以下。 温度的变化反应酒醅发酵与否。酒醅温度变化反映酒醅发酵的正常与否。 清香型白酒大楂和二楂发酵过程中温度呈现 “前缓、中挺、后缓落”的变化规律[11]，这是微生物的生长代谢产生生物热与酒醅发酵环境热能传递平衡的结果。

图2 酒醅发酵过程中温度的变化Fig.2 The temperature changes of the fermented grains in the brewing process

2.3 酒醅发酵过程中pH 和酸度的变化

随着发酵的进行，大楂酒醅的pH 值从0 d 时的5.48 变为28 d 时的3.36 （图3）。 其中，1～3 d，pH 值下降较快，从pH 5.5 降到pH 4.6，下降1 个数量级， 其原因可能是由于在此过程中酵母菌大量生长繁殖，产生大量的CO2，使得酒醅pH 值迅速下降；3～15 d，pH 值变化幅度较前期变小，其原因主要是酒醅中的氧气已消耗殆尽， 酵母从有氧生长阶段进入无氧发酵产酒精阶段；15～28 d，随着pH 值和酒精度的升高，酒精发酵趋于停止，此时发酵液中的乳酸菌等厌氧或兼性厌氧菌再生长，产生有机酸，如乳酸、醋酸等，使pH 值下降。二楂酒醅pH 值的变化趋势同大楂相似（图3）。所不同的是二楂发酵的起始pH 值较低， 为4.2，这可抑制大部分霉菌和细菌的生长。 由此推测发酵起始没有霉菌的生长。 发酵28 d 时，其pH 值为3.27，这与大楂28 d 的pH 值相近，推测当pH3.3时酒醅中产酸微生物的发酵受到抑制。为此，笔者跟踪了发酵30 d 酒醅的pH 值，发现其pH 值基本不变，表明产酸菌在pH3.3 时生长、繁殖、代谢基本停止。

酒醅发酵过程中大楂、 二楂的酸度均呈上升趋势，其中，二楂比大楂产生的酸度高（图4），这不同于大、二楂的pH 值在发酵后期几乎相同（图3）。 产生这种情况主要原因是pH 值变化反映游离H+量的变化；而酸度变化反映电解和未电解的所有酸的H+。 发酵过程中产生的酸类物质主要为有机酸，而大部分有机酸为弱酸，且不同的有机酸的电解能力略有差别。 这可能是造成酒醅二楂酸度升高，而pH 值变化不大的原因。 以上结果表明清香型白酒酒醅具有较强的缓冲能力[11]。

图3 酒醅发酵过程中pH 值的变化Fig.3 The pH changes of the fermented grains in the brewing process

图4 酒醅发酵过程中酸度的变化Fig.4 The acidity changes of the fermented grains in the brewing process

2.4 酒醅发酵过程中水分含量的变化

酒醅发酵过程中水分的来源有两个方面：一是酒醅发酵前，外界添加水分；二是酒醅发酵代谢过程中，生理生化反应，消耗和产生的水分。 水的作用是多方面的，包括润粮，传递热量，保证粮食均一糊化；为酒醅发酵特供溶剂，使固态发酵体系呈现较均质的体系；为微生物的发酵生长、繁殖、代谢提供水分活度。 酒醅发酵过程中水分含量的多少影响微生物代谢生长及菌群结构， 微生物的代谢生长又影响酒醅发酵过程中的水分含量。 清香型白酒大、 二楂酒醅发酵过程中水分变化见图5。 大、二楂酒醅起始发酵水分含量不同，大楂为50%，二楂为60%。 随着发酵的进行，水分整体呈上升趋势，发酵23 d 后，水分含量基本保持稳定，分别达63%，70%左右。

2.5 酒醅发酵过程中淀粉含量的变化

淀粉是酒醅发酵过程中微生物产生酒精及其它碳水化合物的底物， 它浓度的大小影响发酵快慢及出酒率的高、低。随着发酵的进行，大、二楂酒醅中淀粉含量均呈递减的趋势。大楂发酵过程中，0～7 d 淀粉含量下降较多，7～17 d 淀粉含量下降变缓，17～21 d 淀粉变化又大，21 d 后淀粉含量变化趋于稳定。 二楂发酵过程中，0～7 d 淀粉含量下降偏少，7～21 d 淀粉含量的变化大，21～23 d 淀粉下降最多，23 d 后淀粉含量保持不变。酒醅发酵过程是淀粉酶水解淀粉的过程（图6）。 淀粉酶的来源可能有两种：一是大曲直接带入酒醅的淀粉酶，这类酶随着发酵温度及环境pH 值的降低而降低，在发酵过程中引起淀粉含量变化变缓； 二是酒醅发酵过程中微生物此消彼长， 顺序生长代谢产生的淀粉酶。 在发酵过程中这类酶可能引起淀粉含量变化大。 依据大、 二楂酒醅发酵淀粉含量变化趋势， 推测清香型白酒酒醅发酵过程中淀粉酶的来源应包括以上两种。 清香型白酒的生产，提倡“养大楂，挤二楂”[12]，以保证出酒率和酒的品质。 笔者认为通过控制酒醅中淀粉的释放及淀粉的水解程度可达到以上目的， 这是因为在大楂发酵过程中过多淀粉的暴露及淀粉的水解导致大楂发酵后期还原性糖含量较高， 而发酵后期主要微生物为乳酸菌，还原性糖被乳酸菌快速利用，这将促进淀粉的消耗和大楂酒醅酸度的提高， 从而影响二楂的出酒率和质量。

图5 酒醅发酵过程中水分含量的变化Fig.5 The water content changes of the fermented grains in the brewing process

图6 酒醅发酵过程中淀粉含量的变化Fig.6 The starch content changes of the fermented grains in the brewing process

2.6 酒醅发酵过程中还原性糖含量的变化

酒醅中还原性糖含量动态变化的过程主要是酶催化底物产还原性糖和还原性糖被微生物消耗、利用的过程。 由图7 可知，还原性糖含量先升高后降低再升高再降低，至逐渐趋于平缓。造成以上现象的原因是由于糖化酶分解淀粉， 产生的还原糖被酵母利用，促使酵母生长、繁殖、发酵。发酵初期（0～3 d），酵母生长、繁殖阶段，还原糖的产生大于还原性糖的利用；发酵3～15 d，酵母发酵产酒精阶段，还原糖的产生小于还原性糖的利用；发酵15～21 d，酵母对还原性糖的利用降低，清香型白酒酒醅中还原性糖含量降低， 这表明该阶段酵母酒精发酵产酒结束， 还原糖的产生大于还原糖的利用；21 d 后，随着发酵的进行，酒醅酸度升高，对糖化酶活力具有抑制功能，使还原性糖含量降低。

2.7 酒醅发酵过程汇总酒精含量的变化

酒醅发酵过程中酒精含量的变化反映酒醅中酿酒酵母的生长代谢状况。 由图8 可知，在0～3 d期间， 酒醅中酒精含量变化不大，3 d 后酒精含量逐渐升高，15 d 左右，酒精含量达到最高值，之后，酒精含量略有降低（图8）。 产生以上现象的原因主要是0～3 d 为酵母菌体有氧生长增殖过程；发酵4～15 d 为酵母无氧酒精发酵的旺盛期；发酵15 d 后，由于酵母菌处于低pH 值、高酒度的环境，酵母菌的生长、繁殖、代谢受到抑制[13]。 在发酵后期，一些厌氧微生物利用酒精生长或酒精与乙酸发生酯化反应，造成后期酒精含量略微降低。

图7 酒醅发酵过程中还原糖含量的变化Fig.7 The reducing sugar content changes of the fermented grains in the brewing process

3 讨论

清香型白酒的发酵过程是微生物生长代谢繁殖的过程， 也是微生物及其代谢产物作用于发酵基质产生酒精及白酒风味的过程。 推动酒醅发酵的微生物及其代谢产物主要来源为大曲。 大曲的质量和品质对清香型白酒的生产及品质具有重要的影响[14]。 考察大曲品质的重要指标之一为淀粉酶活力及生物学活性。 通过对酒醅中淀粉及其它理化指标的研究发现，大楂酒醅中淀粉水解程度，影响酒醅的产酒和品质。淀粉水解程度低，影响出酒率；淀粉水解程度高，发酵后期还原糖含量高，助推乳酸菌生长，消耗淀粉，引起大楂酒醅后期产酸高，从而影响二楂酒醅出酒率和白酒的品质。为控制以上现象， 应调节控制淀粉酶的活力及环境耐受性。淀粉酶具有一定的糖化酶和液化酶活力，对酒醅中的酸、 酒度、 温度具有一定的环境耐受性，同时，淀粉酶的环境耐受性也不能太高，以防止发酵后期产生太多的还原性糖，促进酒醅变酸，影响出酒率和品质。为此，在大曲标准的制定过程中，应根据酒醅中环境及理化指标的变化规律，建立大曲淀粉酶活力范围及其耐受酒醅酒度、 酸度等理化指标的范围。

图8 酒醅发酵过程中酒精含量的变化Fig.8 The alcohol content changes of the fermented grains in the brewing process

4 结论

1）清香型白酒大楂和二楂酒醅发酵过程中主要的微生物为酵母、细菌。乳酸菌是酒醅发酵后期的主要细菌。

2）大楂和二楂发酵过程中淀粉含量变化趋势有所不同， 推测淀粉的水解程度影响酒醅能否正常发酵以及大楂和二楂的出酒率和白酒的品质。 在大楂发酵过程中，应控制淀粉的水解，以防酒醅后期产酸，影响大楂的酒质和二楂的出酒率。

3）温度在酒醅发酵过程中均呈现“前缓、中挺、后缓落”的变化趋势，发酵最高温度在7 d 左右；酒度发酵15 d 左右趋于稳定。 pH 值在大楂和二楂酒醅发酵过程中逐渐降低，pH 3.3 时趋于稳定。