响应面法优化超声辅助提取白簕多糖工艺研究
2020-08-31郭鑫磊赵雨晴王宝庆
郭鑫磊，赵雨晴，徐 汉，杨 娜，王宝庆
(哈尔滨商业大学 药学院 省预防治疗老年病药物研究重点实验室 财政部中央与地方共建实验室，哈尔滨 150076)
白簕学名(Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.)五加科五加属药食两用植物.多糖为结构十分复杂的一种物质[1]，它是一类重要天然资源，是食品中研究的主要对象之一，大量研究显示多糖拥有很多生物功能，包括抗氧化、抗炎、降血糖等[2].植物多糖是由提取、分离、纯化而获得的一种具有活性的天然大分子物质，其在植物体内广泛存在.人们开始了解到多糖拥有无毒、无害特点，同时具有多种多样的生物学作用、来源途径很广、可以作为新兴饲料的添加剂[3].目前，针对植物多糖的药理作用探究已经成为热点，已经证实植物多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症等多种生物功能[4].
1 实验部分
1.1 实验材料
1.1.1 仪器
超声波细胞粉碎机 新艺超声设备有限公司，N-1000旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司，LAMBDA 650紫外可见光分光光度计 珀金埃尔默公司，3K30低温离心机 SIGMA公司，循环水真空泵SHB-95 郑州杜甫仪器厂
1.1.2 试剂与材料
实验试剂：氯仿、蒽酮、浓硫酸、酒石酸钾钠、乙醇、硫酸铜、葡萄糖等都是分析纯.
实验材料：白簕(购自哈尔滨三棵树药材大市场)
1.2 实验方法
多糖的分析采用蒽酮-硫酸法,用葡萄糖作对照品，测定吸光度
1.2.1 标准曲线的绘制
吸取葡萄糖标准液，置干燥试管中分别加水稀释，冷水冷却5 min，然后向其中放入新配制蒽酮-硫酸溶液4 mL，混匀，沸水浴升温，室温冷却，在620 nm测吸光度，用质量浓度对吸光度做标准曲线，得回归方程为：A=56.81C-0.0087，r=0.999 7[5].
1.2.2 超声提取工艺流程
精准称量自然干燥的白簕粉(过40目筛)5.00 g，置于500 mL空瓶中，加提取试剂，用超声波细胞粉碎机进行分离提取，收集提取液并旋转蒸发至50 mL.以Savage方式去蛋白，在溶液里放正丁醇和氯仿(1∶4)，对溶液进行摇晃，持续20 min，使其混和均匀，离心10 min(4 000 r/min)，水相进行相同操作.对样品离心10 min，弃上清，定容至250 mL.按蒽酮-硫酸法测样品中多糖含量[6].
提取率(%)=(白簕茎皮中所含的多糖质量/白簕的茎皮质量).
1.2.3 白簕中多糖提取单因素考察
1)溶剂的选择
精准称量5.00 g白簕粉，然后分别选择水、乙醇、丙酮作为溶剂，按料液比1∶25(g/mL)，于超声波细胞粉碎机中，在100 W下提取30 min.以1.2.2项下流程得出提取率.
2)料液比的选择
精准称量5.00 g白簕粉，用体积分数70%的乙醇作为提取溶液，按照料液比是1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g/mL)，在100 W下进行提取25 min.以1.2.2项下流程得出提取率.
3)乙醇体积分数的选择
精准称量5.00 g白簕粉，在料液比1∶25(g/mL)，超声功率100 W、提取时间25 min的条件下，分别用体积分数20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇于超声波细胞粉碎机中进行提取.以1.2.2项下流程得出提取率.
4)提取时间的选择
精准称量5.00 g白簕粉，用70%的乙醇在料液比1∶25(g/mL)、超声功率100W的要求下，提取5、10、15、20、25、30、35、40 min.以1.2.2项下流程得出提取率.
5)超声功率的选择
准确称取5.00 g白簕粉，用70%的乙醇在料液比1∶25(g/mL)的条件下，分别于超声功率为50、60、70、80、90、100、110、120 W，用超声波细胞粉碎机提取25 min.以1.2.2项下流程得出提取率[7].
1.2.4 响应面设计方案
将料液比、溶剂乙醇体积分数、提取时间、超声功率这些条件作为自变量，进行响应面分析[8].实验因素水平设计见表1.
表1 因素水平设计表
2 结果与讨论
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同有机溶剂的选择
为了选好的提取剂，分别以无水乙醇、丙酮、水作为多糖提取剂，进行单因素试验，提取率分别为5.93%，5.12%，4.26%.根据结果发现，以乙醇作为溶剂所得的提取率最高，所以选择溶剂是乙醇.
2.1.2 料液比的选择
料液比分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g/mL)时，相应的多糖提取率见图1.
图1 料液比对提取率的影响
由图1可知，料液比从1∶5到1∶20，提取率从5.46%上升到6.43%；料液比由1∶20到1∶40，提取率从6.43%下降到5.42%.原因可能是料液比太高，干扰白簕里多糖溶出；料液比过小，会减小提取剂的体积分数.最佳单因素是1∶20[9].
由表3可知，采用SNCR+PNCR联合脱硝NOx控制在100 mg/m3时，20%氨水耗量为4.0 kg/t，PNCR还原剂耗量为2.0 kg/t，运行成本为11.9元/t；根据现场运行情况，NOx去除效率越高，PNCR药剂所需喷量越大，氨逃逸越大，PNCR系统堵料概率越高，导致NOx排放值波动越大。
2.1.3 乙醇体积分数的选择
乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%时，相应的多糖提取率见图2.
图2 乙醇体积分数对提取率的影响
乙醇的体积分数不断升高，提取率开始增大后减小，达到80%，提取率最大.原因可能是多糖在不同体积分数的溶剂中溶解效果不同，体积分数≤80%，溶解度因体积分数升高而升高；体积分数>80%，溶解度随体积分数增加而下降.最佳单因素是80%[10].
2.1.4 提取时间的选择
进行提取的时间是5、10、15，20、25、30、35、40 min时，所得结果见图3.
图3 提取时间对提取率的影响
时间在20 min以前，随着时间增加，提取率上升，时间到达20 min时，提取率最大，20 min以后开始下降.原因可能是多糖在20 min基本提取完成，达到最大的提取率；时间增加，一些多糖被降解成单糖溶解在乙醇里，在醇沉过程中会损失一部分，造成提取率减少.最佳单因素是20 min[11].
2.1.5 超声波功率的选择
进行实验的超声功率分别是50、60、70、80、90、100、110、120 W，见图4.
图4 超声功率对提取率的影响
由图4可知，功率不断增大，提取率先上升后下降，功率达到100 W，提取率最大.此结果可能是因为提取率因功率升高而上升；但是功率过大则造成温度太高，多糖被水解，提取率降低.最佳单因素是100 W[12].
2.2 响应面结果与分析
对单因素实验得到提取工艺采取优化，实验结果见表2.
将表2所得实验数据进行分析，回归模型方差分析见表3.
表2 响应面实验设计结果
表3 二次项模型的线性系数及方差分析
运用Design Expert 10.0软件做多元二次拟合，所得提取率(Y)和料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)、超声波功率(D)回归模型为：提取率=6.52+0.087A-0.027B-0.072C+0.089D-0.075AB-0.02AC+5.0AD+0.077BC+0.085BD-0.017CD-1.11A2-0.015B2+0.019C2+0.06D2
由表3可知，回归模型显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P=0.595 1>0.05)，R2=0.993 3，证明可以使用该模型对白簕中多糖提取率进行预测[13].由表3分析可以看出，一次项料液比及超声功率对结果有很大作用，都是P<0.000 1；时间对结果作用其次，体积分数对结果作用最小；干扰因素的效果是超声功率>料液比>提取时间>乙醇体积分数.
由此对其回归方程进行优化得新的二次回归方程为：提取率=6.52+0.087A-0.027B-0.072C+0.089D-0.075AB+0.077BC+0.085BD-1.11A2+0.06D2
由回归方程得出响应面分析图，见图5～10.
图5 料液比与乙醇体积分数作用影响多糖提取率曲线
图6 乙醇体积分数与提取时间作用影响多糖提取率曲线
图7 乙醇体积分数与超声功率作用影响多糖提取率曲线
图8 料液比与提取时间作用影响多糖提取率曲线
图9 料液比与超声功率作用影响多糖提取率曲线
图10 提取时间与超声功率作用影响多糖提取率曲线
从图5～10可以看出，不同因子交互作用对结果的干扰.通过查看6组图，料液比与体积分数、体积分数与时间、体积分数与功率间关系对结果影响较大[14]；时间与功率、料液比与时间及料液比与功率间关系对结果干扰很小.此结果和方差中二次项结果一致[15].
根据以上结果得出多糖最终提取方法是：料液比1∶20.318 209(g/mL)、乙醇体积分数71.490 62%、提取时间15.000 07 min、超声功率99.999 85 W，这时白簕中多糖提取率可以得到的理论最大值是6.89%.为便于实际操作，修改为料液比1∶20(g/mL)、乙醇体积分数72%、提取时间15 min、超声功率100 W，所得实际提取率为6.85%，数值接近.
3 结 语
本文以白簕粉末作为原材料，采用超声波法对白簕中的多糖进行提取，采用超声波法对白簕中多糖提取的最优条件为：料液比1∶20(g/mL)、乙醇体积分数72%、提取时间15 min、超声功率100 W.结果表明，采用超声波法提取白簕多糖，具有方法操作性好、结果好、快速准确等优点，能够为将来白簕的继续深入研究做好基础性工作，推动白簕相关应用研究的发展.
