自然越冬过程中大叶黄杨抗寒性生理指标的动态变化

袁宗英，赵欢欢，杨铭鑫，田海月，刘爱娜

（1 山东省青岛市农业技术推广中心 266071；2 青岛农业大学园林与林学院；3 青岛城市农人农业科技有限公司）

常绿植物是植物大类中的重要组成部分，也是园林绿化中较为常见的植物类型。南方地区常绿植物种类丰富，而相对于南方，北方水热条件相对较弱，所以常绿植物种类少，长势也不如南方好[1]。在北方条件不如南方好的前提下，常绿植物的引种驯化成为了重中之重[2]。北方冬季相对寒冷，植物细胞容易结冰，造成细胞液和细胞壁分离，从而造成植物的冻害，甚至死亡。所以，研究常绿植物冬季的抗寒机理显得十分重要。大叶黄杨（Euonymus japonicus Thunb）作为北方的一种常见的常绿植物，在园林绿化中应用范围很广。该植物叶片肥大，生长良好，是一种很好的研究材料。

1 材料与方法

1.1 研究材料

选择青岛农业大学主楼后6 棵大叶黄杨为对象。

1.2 研究方法

2015 年11 月～2016 年3 月进行测量，每15 天测量1 次，测量时间是在每天的9：00～11：00 之间。测量时的天气要晴朗，有阳光，如遇到下雨天、阴天，则延后到天气晴朗时再进行测量。测量的主要因子有：叶片含水率、电导率、POD、SOD、可溶性蛋白。

1.2.1 叶片含水率的测定。首先称量叶片的重量，记录M1，然后把叶片放入105℃杀青30min，再将温度调至80℃恒温烘，直到叶片重量不变，记录重量M2，算出叶片的失水率。叶片失水率（%）=（M2-M1）/M1×100。

1.2.2 电导率的测定。采用电导法，用DDS-11A 电导仪测定。选取功能状叶片，先用流水冲洗，再用蒸馏水清洗3 次，用滤纸擦干叶面上的水分，用剪刀剪成5mm左右的小块，用电子天平称量0.3g，放入烧杯，加入20mL 蒸馏水，在室温下静置2h，测定电导值为k1，再将其放入沸水浴中，煮沸20min。取出冷却至室温，平衡20min，摇匀，测其最终电导率k2[3]。相对电导率计算公式：E（%）=k1/k2×100。

1.2.3 POD 的测定。①酶液提取（下同）：取一定部位的植物叶片（根据需要而定，去掉叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加入2mL 预冷的提取介质（里面含1%的聚乙烯吡咯烷酮0.05mol/L，pH=7.8 的磷酸缓冲液）在冰浴上研磨成浆，再加上提取介质冲洗研钵[4]，使最终体积为10mL，于4000rpm 下离心20min，上清液即为SOD、POD、MDA 的粗提取液，使用4℃冰箱保存备用[5]。②反应混合液的制备：取0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH=6）50mL 放于烧杯，加入愈疮木酶溶解，待溶液冷却后，加入30%的H2O219μL，均匀混合，保存于4℃冰箱备用，每个处理取2 支试管编号，各加入反应混合液3mL，其中1 支加入0.1mL 酶液，另1 支以0.05mol/L（pH=7.8）的磷酸缓冲液代替。用不加酶液的试管调零，从2 号管开始，每加1 支酶液，立即用分光光度计在470nm 比色，每隔15s 记录1 次吸光度值A470，读取0～2min 的A470 值。

计算公式：POD=（△A470×Vt）/（0.01×Vs×W×T）

其中，△A470 指反应时间里吸光度△A470 的变化，Vt 指提取酶液的总体积，W 指样品鲜重，Vs 指测定时取用酶液体积，T 指反应时间。

1.2.4 SOD 的测定。①酶液提取：（同上）显色反应：取5mL 指形管（要求透明度好）4 支，2 支为测定管，另外2 支为对照管，按下列加入各溶液：0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5mL，130 μmol/Lmet 溶液0.3mL，750 μmol/L NBT溶 液 0.3mL，100 μmol/L 的 EDTA-NA2 液0.3mL，20μmol/L 核黄素0.3mL，酸液0.1mL，在2 支对照管中，用缓冲液来代替酶液，蒸馏水0.5mL，把总体积3.3mL 混匀之后把1 支对照管放在暗处，其他管于4000Lx 日光下反应30min。②SOD 活性测定与计算：等到反应结束，用不照光的对照管作为空白，分别测量其他管的560nm 的吸光度，已经了解到SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原50%为一个酶活性单位表示。

计算公式：SOD=（Ao-As）×Vr/（Ao×0.5×W×Vs）

式中，Ao：照光对照管的光吸收值；As：样品管的光吸收值；Vr：提取液的总体积；Vs：测定时取用酶液的体积；W：样品鲜重。

1.2.5 可溶性蛋白的测定。选择考马斯亮蓝G-250 染色法来测定可溶性蛋白含量。需要配置标准曲线方程；配置0、20、40、60、80、100μg/mL 浓度的标准蛋白溶液，各取1mL，加入5mL 的考马斯亮蓝溶液并摇匀，2min后在595nm 的波长下测定吸光度值。以吸光值为横坐标、蛋白质含量为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。取SOD 粗酶液0.1mL，加入0.9mL 的蒸馏水和5mL 的考马斯亮蓝G-250 试剂，均匀混合，静置2min 后在595nm 下比色，记录吸光值，并通过标准曲线获得蛋白质含量计算公式：

样品蛋白质含量=C×V/（a×W×1000）

其中，C：标准曲线上查得的蛋白质；V：提取液总体积；A：测定时用的提取液体积；W：样品鲜重。

2 结果与分析

2.1 大叶黄杨在冬季不同温度下含水率的变化规律与耐寒性

结果表明，11 月～翌年1 月，鲜重含水率表现为下降趋势，从0.64 下降到了0.59。2～4 月，大叶黄杨的含水率呈现回升趋势，从0.61 升高至0.65，但是3 月中旬的含量还是比不上11 月的含水率，直到4 月份的时候，含水率才略高于11 月份。1 月份温度最低，所以这时候大叶黄杨的含水率也最低；4 月份天气转暖，温度较高，大叶黄杨的含水率达到了这几个月的最高值。

2.2 大叶黄杨的电导率变化与耐寒性

当质膜的选择透性被破坏时，细胞内部电解质外渗，其中含有盐类、有机酸等这些物质之后便会进入到环境介质中，加入环境介质是蒸馏水的话，那么这些物质的外渗会导致蒸馏水的导电性变强，所以，电导率就会增加。植物受伤害越多，越严重，造成外渗的物质也就越多，介质导电性就会变得越强，试验过程中测得的电导率也就越高，但是不同抗性品种就产生抗性上的差异[6]。

由图2 表明，在温度较低、生长环境相对较差的情况下，大叶黄杨的电导率较高，而在条件相对较好的环境条件下，该植物的电导率较低。11～12 月，电导率呈直线上升的趋势，12月份电导率最高，为0.81us/cm；从12 月开始～翌年4 月，电导率逐渐降低，由于2 月份有气温上升，所以电导率出现大幅度回落，到3 月份电导率又变高，4 月份气温稳步上升，所以电导率也逐渐降低。由此可见，植物电导率高，耐寒性高，电导率低，耐寒性差。

图1 含水率变化图

图2 电导率变化图

2.3 POD 与耐寒性

POD 的主要功能是催化H2O 分解，氧化其底物所产生的过氧化物。POD 在与CAT 协同清除H2O2中也起着很重要的作用。11～12 月，气温降低速度快，POD含量增高至最高值。12 月之后，一直到次年4 月份，POD开始逐渐降低，1～2月、3～4 月降低速度较快。

2.4 SOD 与耐寒性

11～12 月，大叶黄杨生长的环境昼夜温差较大，室外温度在5～20℃，该植物生长趋势良好，当逐步迈入越冬前的抗逆锻炼阶段，叶片中的SOD 的活性增强。12 月上旬～翌年2 月上旬，温度较低，开始土壤霜冻期，晚上气温降至5℃甚至0℃以下，大叶黄杨SOD 活性呈下降。2 月上旬之后，温度有所回升，SOD活性基本可以维持在1 月份的水平。3 月上旬之后，气温上升，天气回暖，温度可到5～20℃，新芽相继萌发，头年叶逐渐衰老，叶片中SOD 活性降低。

归纳上述3 个阶段可以得出这样的结论：作为常绿植物，大叶黄杨作越冬期间SOD 活性变化曲线均呈现M 状，SOD 活性并不随气温下降而减弱，和温度变化无正相关关系。

图3 POD 变化图

图4 SOD 变化图

2.5 可溶性蛋白与耐寒性

可溶性蛋白含量11～翌年12 月变化不大，12 月～翌年1 月呈上升趋势；由于2 月回温，可溶性蛋白含量降低了些；3 月份气温又降低，可溶性蛋白含量升高；4月份气温升高，可溶性蛋白含量降低。可见可溶性蛋白与气温有着密切的关系，会随着温度的升高含量降低。

图5 可溶性蛋白变化图

3 结论与讨论

植物细胞膜是用来交换、调节和控制细胞内外物质，它最重要作用是具有选择透性。每当植物面临逆境伤害，细胞膜受到了不同程度的破坏，膜的透性增强了，选择透性消失了，细胞里面的电解质向外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常用于评价逆境伤害的一个生理指标，在植物抗性生理研究中应用比较广泛。

在植物处在不利环境时候，通过代谢反应来阻止、降低或修复由逆境造成的伤害，使植物仍能保持正常的生理活动。例如植物遇到干旱或低温时，细胞内的渗透物质含量会上升，以提高细胞抗性。大叶黄杨在冬季代谢速率降低，植物通过降低含水率来增加细胞液渗透压，增强了植物的耐寒性，在气温较低的情况下可以保护植物细胞液冻结，防治植物失水造成植物冻害。叶片含水率降低，渗透压增高，电导率也随之增高。

在自然越冬时或者各种逆境发生时，植物体的水分状况变化具有相似性，逆境时植物吸水力降低，蒸腾量降低，但蒸腾量大于吸水量，使植物组织的含水率降低并造成植物叶片等萎蔫。植物含水率的降低使组织中束缚水含量相对自由水更高，从而又使植物的抗逆性增强。低温造成的寒害、冻害等常给植物的种植和生长带来不小的影响。试验表明，SOD 与大叶黄杨的耐寒性并没有正相关关系，而POD 则会因为气温的降低而升高。

可溶性蛋白作为重要的渗透调节物质和营养物质，它们在叶片中的增加和积累能够提升细胞的保水能力，对于细胞的生命物质及生物膜可以起到保护的作用，所以可溶性蛋白也是考量大叶黄杨耐寒性的重要指标之一。试验表明，在气候恶劣，气温较低的情况下，叶片中的可溶性蛋白含量明显升高。

综上所述，这5 个因子中4 个因子与大叶黄杨的耐寒性相关。在以后的研究中可以考虑叶片含水率、电导率、POD、可溶性蛋白4 个因子。叶片含水率降低时，大叶黄杨的耐寒性较好；电导率升高，大叶黄杨抗寒性强；POD、可溶性蛋白升高，大叶黄杨耐寒性增强。