支原体DNA 载量和耐药基因23SrRNA 的2063 和2064 位点突变检测在儿童支原体肺炎诊疗的应用

丁臻博，段 晶，鲁 萍，黄永坤，赵亚玲，罗 艳

（昆明医科大学第一附属医院儿科，云南昆明 650032）

儿童肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）：又称原发性非典型肺炎，因肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae，MP） 感染所引起的肺部炎症，是学龄儿童及青少年常见的一种肺炎。主要通过呼吸道飞沫传播，近年婴幼儿发病增多。全年皆可发病，3～7 a 流行1 次[1]，占住院儿童社区性获得肺炎的10%～40%，MP 流行时可以增加至3～5 倍[2]，近年来临床发病率增高趋势明显。病程持续2～3 周左右，以发热，似百日咳样阵发性剧烈干咳为主要表现。因MP 体外培养需要时间长，病原菌免疫检测特异性抗体产生2周，故不能尽早诊断，近年来MP 对大环内酯类的耐药性越来越强，尤其是23SrRNA 基因突变，各个地区对大环内酯类的耐药率差别明显不同[3]，给临床诊疗带来困扰。本研究通过于PCR 方法快速检测呼吸道分泌物MP-DNA 载量早期诊断，同时检测抗生素作用靶位23SrRNA 的2063 和2064 位点基因突变情况判断是否耐药，为临床诊疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017 年3 月至2019 年9 月昆明医科大学第一附属医院儿科因下呼吸道感染住院患儿224例为研究对象，其中男122 人，女102 人。年龄为1～13 岁，平均（5.57±3.34） 岁，入院24 h 严格规范采集痰液和咽拭子的呼吸道分泌物标本并及时送检。纳入标准：（1） 根据《诸福棠实用儿科学》第8 版MPP 诊断标准[1]；（2） 年龄0～14岁儿童；（3） 临床资料完整。排除标准：（1）既往免疫功能异常；（2） 重症肺炎未痊愈；（3）合并结缔组织和先天性免疫功能缺欠。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 所用 PCR 仪为宏石SLAN-96P 实时荧光定量PCR 仪，试剂为江苏默乐生物科技股份有限公司生产的MP 核酸及耐药突变位点检测试剂盒（荧光PCR 法），严格按照试剂和仪器的说明书操作。

1.2.2 检验方法（1） DNA 提取：采用热裂解法对收集的咽拭子、痰液样本进行操作。①咽拭子样本：加入1 mL 左右的无菌生理盐水，充分振荡混匀后，吸取上清400 μL，13 000 r/min 离心10 min，弃上清液，向沉淀中加入50 μL 裂解液和5 μL 内标液，充分振荡混匀后，100℃恒温处理10 min，冷却至室温，13 000 r/min 离心2 min，上清液即为DNA 模板。②痰液样本：加等体积无菌生理盐水，充分振荡1 min，吸取上清400 μL，13 000 r/min 离心10 min，弃上清液，向沉淀中加入50 μL 裂解液和5 μL 内标液，充分振荡混匀后，100℃恒温处理10 min，冷却至室温，13 000 r/min离心2 min，上清液为DNA 模板。（2） DNA 扩增：配置PCR 反应液，将装有PCR 反应液的PCR反应管中分别加入制备好的标本5.0 μL，同时做质控样本和阴性对照。PCR 反应扩增参数：50℃2 min；95℃2 min；91℃15 s，64℃1 min，40 个循环。荧光信号的收集定为FAM（2063 或2064 A:G突变）、VIC（MP）、CY5（内标）。

1.2.3 结果判读 荧光定量PCR 的结果以Ct 值显示，其中阴性对照的目的基因应为UNDET 或FAM荧光Ct≥35.33、VIC 荧光Ct≥35.01，强阳性对照的目的基因Ct 值均位于20.00～25.00 之间；弱阳性对照的目的基因Ct 值均位于29.00～34.00 之间；内标的Ct 值应≤35。结果判定标准如下：（1） 检测样本显示UNDECT 或无典型S 型扩增曲线时，为阴性样本，检测样本FAM 荧光（2063 或2064 A:G 突变） Ct≥35.33、VIC 荧光（MP） Ct≥35.01时，为阴性样本，表明无MP 感染，未发生2063或2064 突变；（2） 检测样本FAM 荧光Ct≥35.33、VIC 荧光Ct＜35.01 时，为阳性样本，表明MP 阳性，未发生A2063 或2064 耐药突变；（3）检测样本FAM 荧光Ct＜35.33、VIC 荧光Ct＜35.01时，为阳性样本，表明MP 阳性，发生A2063G 或2064G 耐药突变。

1.3 统计学处理

采用统计学SPSS 软件进行数据处理，突变和感染率等计数资料用n（%） 描述，组间比较采用Kappa 分析和χ2检验。计量资料服从正态分布用描述。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MPP 感染与MP-DNA 载量、23SrRNA 的2063 和2064 耐药突变位点检测情况

224 例下呼吸道感染中MPP 71 例，感染率为31.69%男41 例，女30 例（男：女=1.36），其中检出MP-DNA 阳性27 例，阳性率：38%;男17 例，女10 例，（男：女=1.7），其中检出23SrRNA 的2063 和2064 位点突变耐药基因19 例，灵敏度为70.4%，特异度为100%，Kappa 值为0.746。说明基因检测MP 结果特异度较高，一致性中等，见表1。以呼吸道分泌物检测MP 结果为金标准，对基因检测支原体结果进行诊断试验的比较，灵敏度为19/27=70.4%，特异度为44/44=100%，Kappa 值为0.746。

2.2 不同指标的呼吸道分泌物检测MP 结果比较

不同性别的分泌物检测MP 阳性率比较，差异无统计意义（P＞0.05）。不同年龄的呼吸道分泌物检测MP 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

年龄和阳性率间存在线性趋势，趋势检验结果：随着年龄增加，阳性率在增加χ2=4.324，P=0.0376，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 呼吸道分泌物检测MP 结果和基因检测MP 结果比较（n）Tab.1 Comparison of MP results for respiratory secretions and MP results for genetic testing （n）

表2 不同指标的呼吸道分泌物23SrRNA 的2063 和2064 位点突变检测结果比较［n（%）］Tab.2 Comparison of detection results of 2063 and 2064 point mutations of 23SrRNA of respiratory secretions with different indexes［n（%）］

3 讨论

近些年在我国很多地区，儿童MPP 发病率明显提高，具有一定的流行性。本研究MPP 占下呼吸道感染的感染率为31.69%，其中MP-DNA 检出率38%，随着年龄增加，阳性率在增加，符合大多数国内外报道10%～40%区间的报道[2-3]。MP在体外能够进行自我复制且不依靠活细胞存活的最小微生物之一。MP 体外培养检出诊断本病有接近100%特异度，但是培养过程复杂，Mp 菌株生长缓慢，需要经过多次传代培养可能出现阳性反应，敏感度为34.78%[4]。培养周期2～4 周、体外分离培养比较困难，多用于实验室研究，并不适用于临床。在1967 年前后有学者研究[5-6]血清学检测并逐渐应用于临床。目前临床上多采血液标本提取血清检查颗粒凝集试验抗体检测，根据血清学检验结果还要结合患者的年龄、病程、一般情况等因素综合分析，在儿科中对于抗体能力较低的婴幼儿，免疫功能减低、缺陷的人群、产生低滴度或可能不产生抗体等。抗体可在部分治愈者机体会维持4 周左右阳性，期间再次感染患者很难再特定分析。与本研究采用快速PCR 技术检测MP-DNA 载量比较，呼吸道分泌物DNA 检测MP结果为金标准，特异度为100%，灵敏度为70.4%，后者有明显的优势。本研究在常规MPP 其他辅助检查基础上进行呼吸道分泌物MP-DNA 载量检测，用载量标记结果，缩短了诊断时间同时又量化可感染指标，及时准确的得到治疗，在临床工作中收到很好的效果。因咽拭子和痰液标本对于真实反应下呼吸道MP 感染存在差别，故本研究标本尽量采集痰液标本。近年报道难治性、严重甚至致命的MPP 病例增多。一些难治性MPP 患者中出现严重并发症和后遗症，例如气道闭塞，支气管扩张，单侧透明肺等严重后遗症[2]。故早期检测MP-DNA 载量的方法简便、快捷、依从性好、特异性和灵敏性高等特点，为尽早诊断、及时治疗避免并发症和后遗症等提供帮助，值得临床工作中推广。

从2000 年以来，MP 对大环内酯类抗生素耐药性迅速上升，特别在亚洲地区大环内酯类抗生素耐药的MP 感染的患者经常表现为严重的MPP，也是确定早期儿童MP 感染能否发展为轻度或重度肺炎的指标[7]。因为MP 缺乏细胞壁，对于作用于细胞壁的抗生素青霉素、头孢类抗生素等具有天然耐药性，但是对四环素类，喹诺酮类，大环内酯类抗生素敏感。由于四环素类，喹诺酮类药物对于儿童处于生长发育、骨骼长成方面的不良作用，故儿童MP 感染后首选大环内酯类抗生素治疗[8]。根据Guo D X 等报道[9]822 名北京11 家医院患儿中，341 名（41.48%） 通过巢式PCR 检测出MP阳性，236 份（69.21%） 样本23SrRNA 有突变[9]。Loconsole 等[10]报道三个具有大环内酯类药物耐药基因型：两个和一个分别具有A2063G 和A2064G 突变。有多种研究显示，23SrRNA 结构基因位点突变可导致抗生素与核糖体亲和力下降而引起耐药，突变导致的药物结合靶点改变是Mp 对大环内酯类耐药的最重要原因，结构域Ⅴ区A2063G、A2064G 突变导致高水平耐药，中国人DNA 测序23S rRNA 基因中高度流行的A2063G 突变，绝大多数在23SrRNA基因的2063 位显示A至G取代[11-12]。故而可在临床参考23SrRNA 基因突变位点进耐药分析[13]，因此，本研究检测MP 耐药基因检测23SrRNA 的2063 和2064 位点突变并判断其突变与判定大环内酯类抗生素耐药是否具有可行性，为临床治疗加大剂量和疗程提供依据。因为儿童应用静脉输注阿奇霉素注射液安全性存在争议，笔者选择安全性稳定的红霉素注射液静脉滴注剂量：10～15 mg/(kg·次)，每天2 次，尽早开始足量、增加疗程等治疗，本研究中所有病人均转归良好，包括1 例合并多种细菌感染患者，未见治疗无效病例，提示无论是否为MP 耐药菌感染，对于儿童MPP 感染而言，大环内酯类抗生素仍为首选治疗。临床中发现对于不同种类的大环内酯类药物每个病人的敏感度有差别，所以因人选药也是关键，进一步加强大环内酯类抗生素耐药性的监测和监管力度，保证规范合理使用，有效遏制其耐药性发展是关键。MP 重症感染合并多种并发症且药物治疗不佳的病例报道日渐增多[14]。有学者认为临床如遇MPP 发生耐药的情况，可以考虑联合使用广谱抗生素以达到抗感染的目的，此外中药也是有效控制耐药MP 感染的方法之一[15-16]，因此对于MPP 采用早期、及时、准确、综合的治疗方法是行之有效的。

国内外报道[17-18]MP 肺炎发病和严重程度与地区，气象和环境等因素相关性，日本学者报道[19]上诉因素与耐药因素有关。本研究主要为昆明地区患儿，昆明地区是属亚热带高原山地季风气候，季节和温度变化不大，较其他研究比较严重病例发生率明显减低，还需要加大样本量和长期观察，随访进一步研究来评估本地区发病特点。在本研究病例均为入院24 h 采集呼吸道标本，大部分为痰液的下呼吸道标本并及时送检，不排除因标本质量等因素对检出结果的影响，因为对于儿童而言，配合度相对较差，需要操作人员规范熟练迅速的采集标本，所以尽早规范采集下呼吸道分泌物合格标本及时送检是保障检出率的关键，在此前提下进行临床分析，对于病情评估、治疗以及远期预后等因素提供有利依据。此外关于MP-DNA 载量和耐药基因23SrRNA 的2063 和2064 位点突变检查费用随着科技发展和人民生活水平的提高成为呼吸道感染的常规检查。

综上所述，MPP 在儿童社区获得性肺炎比例较高，其分布具有年龄，季节性和地域等差异，对首选药物大环内酯类抗生素具有很高的耐药性，呼吸道分泌物MP-DNA 载量的检测在儿科中特异性和敏感性高、简便易行、儿童依从性好等特点，对MPP 早期诊断提供有利依据；同时检测呼吸道分泌物MP 耐药基因23SrRNA 的2063 和2064 位点突变检测对于及时指导应用大环内酯类抗生素减少严重病例、并发症、后遗症等至关重要[20]，值得临床推广应用。