c-Myc、hTERC 基因检测及HC2-HPV 分子检测对宫颈癌前病变的诊断价值

廖 婧，许长俊，周红林，刘 洋

（1） 昆明医科大学第二附属医院妇科，云南昆明 650101；2） 玉溪市人民医院生殖医学科，云南玉溪 653100；3） 昆明医科大学第二附属医院生殖医学科，云南昆明 650101）

宫颈癌（cervical cancer，CC） 是发展中国家妇女患病率最高的生殖道恶性肿瘤，我国每年新增确诊人数超过13 万，为全球患病人数的28.2%[1]。大样本数据证实，几乎所有CC 和绝大多数宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN） 患者中均可发现HPV 感染[2]，高危型HPV 持续感染者首先出现CIN，其需要10 a 及以上演变至CC，因此国内外专家一致认为高危型HPV 的持续感染是CC 及CIN 的高危因素。目前HC2 HPV检测法是被世卫组织公认的可用于临床的HPV 检测技术，其已被推广使用于世界各国。但由于CC及CIN 的发病率远低于HPV 的高感染率（70%～80%）[3]，提示除HPV 感染外还有其他因素影响CC 的发生和进展，如基因的调控[4]等。有学者发现，c-Myc 基因是位于染色体8q34 上的一个癌基因，其在细胞增值、分化和凋亡等发挥至关重要的作用。已证实该基因的过度扩增与乳癌、胆囊癌、胃肠道肿瘤等多种实体恶性肿瘤的发展预后息息相关，其可能也是宫颈癌的一种潜在标志物[5]。而hTERT 做为端粒酶的催化剂，其通过决定端粒酶活性以影响肿瘤的发生发展和侵袭转移。据相关文献报道，hTERT 的高表达与90%恶性肿瘤均有密切联系[6]，其中也包括宫颈癌。本研究以组织病理诊断为金标准，应用FISH 技术和杂交捕获技术分别检测不同宫颈组织中c-Myc 基因、hTERT 基因与HPV 等生物标志物，旨在探究其与CC 发生发展的关联性，以及c-Myc 基因、hTERT 基因对筛检CC 的应用价值，为CC 的防治提供更全面高效的临床思路和筛查策略。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为1 200 名于昆明医科大学附属第二医院妇科就诊且行宫颈筛查的患者，入选条件为有性生活且已排除妊娠可能、既往未行阴道镜检查、宫颈活检及宫颈局部治疗等，分别行HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 检测，任意一项结果异常者（150例） 行宫颈活检术，以组织病理学为金标准进行分组，其中正常组32 例，CIN 组104 例（包括CINI38 例，CINII/CINIII66 例），CC 组14 例。本研究已通过医院伦理审查委员会审查。

1.2 方法

1.2.1 标本收集及实验步骤 取得患者知情同意后，借助阴窥器显露宫颈，于宫颈鳞-柱交界区域用指定的样本采集刷旋转3～5 圈，后置于保存液内，标记后送检。HC2 技术依照相关试剂盒操作指南完成。FISH 技术亦严格遵照FISH 探针（由北京金菩嘉提供） 操作指南进行检测。

1.2.2 结果判读标准 选择符合条件的100 个细胞计数，即具有完整的细胞核形态且强杂交信号。被特异性探针标记者表现为红色、绿色荧光。阳性判断标准:c-Myc 基因：细胞核内出现多于2 个特定荧光标记者为异常细胞。若异常细胞数/计数细胞总数≥指定数值，则代表c-Myc 基因阳性，其扩增异常。hTERT 基因的阳性判断标准同前。HC2-HPV 的结果判读：≥1.0 pg/mL（≥5 000 copies/mL） 为阳性，＜1.0 pg/mL 则为阴性[7]。

1.3 统计学处理

本实验的相关数据采用SPSS 分析，通过绘制受试者工作曲线（receiver operator characteristic curves，ROC） 来分析c-Myc 基因、hTERC 基因及HC2-HPV 分子检测单独检测宫颈癌前病变的效能。计数资料采用卡方检验和Spearman 相关性检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HC2 -HPV、c-Myc 基因、hTERT 基因检测结果与病理学诊断结果对比

因HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因检测中任意一项结果有异者行阴道镜下活检，共150 例，其中正常组32 例，CIN I 38 例，CIN II/CIN III 66例，CC 组14 例。对上述病理学结果与其HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因结果对比发现，随着宫颈病变的加重，HC2-HPV 感染率、c-Myc 和hTERT 基因表达率均增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 宫颈病变与HC2 -HPV 感染、c-Myc 及hTERT 基因表达的相关性分析［n（%）］Tab.1 Correlation analysis of cervical lesions with HC2 -HPV infection,c-myc and hTERT gene expression［n（%）］

2.2 HC2 -HPV、c-Myc 和hTERT 基因筛检宫颈病变的ROC 曲线分析

HC2－HPV 法单独预测宫颈病变的AUC 为0.699（95%CI:0.613～0.785，P=0.000），灵敏度为91.3%，特异度为48.6%。c-Myc 基因检测法单独筛检宫颈病变的AUC 为0.677（95%CI:0.59～0.763，P=0.000），灵敏度为62.5%，特异度为72.9%。hTERT 基因检测法单独筛检宫颈病变的AUC 为0.687（95%CI:0.601～0.772，P=0.000），灵敏度为58.8%，特异度为78.6%，见图1。

2.3 c-Myc 基因、hTERT 基因表达与HC2-HPV感染在宫颈病变中的关系

随着宫颈病变程度的升级，c-Myc 基因和hTERT 基因的扩增表达率和HC2-HPV 感染率均有不同程度的上升，且c-Myc 和hTERT 两种基因的表达与HC2-HPV 感染率之间呈正相关（r1=0.576，P=0.000；r2=0.545，P=0.000），见表2。

图1 HC2 -HPV、c-Myc 和hTERT 基因单独筛检宫颈病变的ROC 曲线图Fig.1 ROC curves of HC2-HPV,C-MYC and hTERT genes for screening cervical lesions separately

表2 HC2-HPV 阳性、c-Myc 基因阳性及hTERT 基因阳性之间的相关性分析［n（%）］Tab.2 The correlation between the positive result of HC2-HPV,C-MYC and hTERT［n（%）］

3 讨论

CC 的发病人群日益年轻化，但疾病发展却十分缓慢，从最初的CIN 发展至CC 约10～20a，因此早期、及时的诊断和治疗显得尤其重要[8]，现可明确高危型HPV 感染系导致宫颈病变的首要因素，因此及时检测HPV 对于防治CC 具有重要意义。HC2 检测技术是最早被美国、欧洲和中国等多个国家认可并被建议作为HPV 检测的金标准[9]，因为其可在分子水平对13 种高危型HPV 进行HPV-DNA 定性测量（≥1.0 ng/L 即为阳性）。本研究结果显示，与基因检测对比，HC2 技术检测HPV 感染对评估宫颈病变具有较高的灵敏度（91.3%），可显著降低CIN 及CC 漏诊率，这与Yin[10]的文章数据相一致，但特异度较低，存在一定的误诊几率，不可避免会增加患者的心理焦虑及经济负担。因此仅凭HC2-HPV 阳性无法准确判断和评估宫颈病变的严重程度，其在临床中筛查宫颈病变并不全面，需要新的生物标志物来协同判断和评估疾病的严重程度。

c-Myc 基因作为癌基因家族的成员之一，因其通过调控细胞的增殖与凋亡使恶性肿瘤细胞无限增殖，被证实与前列腺癌、胃癌、肝癌等多种实体恶性肿瘤的发生有极强的关联性。近年来多位妇瘤专家与学者也已证实[11]，c-Myc 基因过度表达的患者发生CC 及CIN 的可能性较高，c-Myc 基因或许可成为CC 的特异性诊断指标。本研究数据示，CC 和CIN 组中c-Myc 基因表达扩增率显著高于正常组，提示c-Myc 在CC 和CIN 中过度表达，这与卢建军[12]的结论相一致。基于基因检测技术水平，C-myc 基因的特异度较高，且其与高危型HPV 感染情况密切相关，提示c-Myc 基因检测可以与HC2 法联合作为宫颈病变严重程度的预测标准，提高疾病诊断的准确性。

hTERT 基因是近年来新发现的生物标记物，研究提示它的扩增率会随着宫颈病变级别的增高而增加[13]。作为端粒酶的催化亚基，它的扩增表达情况可影响染色体端粒的长度以使细胞永生化，使肿瘤细胞获得无限生长进化的优势[14]，其对包括CC 在内的多种恶性肿瘤的发生发展十分关键。本研究表明，hTERT 基因在宫颈正常组、CINI 组、CIN II-III 组、CC 组中的表达率分别为12.50%、34.21%、53.03%、85.71% （χ2=28.9，P=0.000）。提示hTERT 基因扩增表达率随宫颈病变的升级而升高，且正常组与CINI 组明显低于CIN II-III 组与CC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），与陈露露等人[15]结论相似。与常用的HC2-HPV 法相比，通过FISH 技术测定hTERT 基因具有特异性高、准确性较好的优点，单独检测该基因对宫颈癌诊断有一定的价值，但是联合其他标志物（如HPV、c-Myc 基因等） 检测将更有意义，能提高CC 及CIN 诊断的敏锐性和准确性[16]。

综上所述，本文论述了HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因检查在筛检宫颈病变中的应用价值，条件允许者建议联合筛查，可显著提升宫颈疾病诊断的灵敏性和特异性，具有可观的诊断应用前景。不仅如此，基于对上述两种基因的深入探究和摸索，现已有相关基因靶向药物或酶抑制剂[17-18]处于研发试验阶段。相信随着医学科技不断进步和发展，c-Myc 和hTERT 基因在宫颈癌的诊治方面会有更大的利用价值。