单次热应激诱导小鼠睾丸间质细胞乙醛脱氢酶蛋白表达的变化

田洪成 孟 夏 马 鹤 王会君 李清春 王雁林

滨州医学院附属医院生殖医学科 山东 滨州 256603

热应激导致睾丸精子缺乏活力和精子减少是通过增加生殖细胞凋亡的方式实现的[1]。本课题组先前研究发现，单次热应激处理后生殖细胞凋亡导致雄性小鼠生育力下降是一过性的，即小鼠睾丸生殖功能呈现一种可逆性变化[2-3]。课题组前期研究发现，单次热应激后小鼠睾丸间质细胞未出现明显凋亡现象[4]。小鼠睾丸间质细胞分泌雄激素，雄激素是维持精子产生的重要激素[5]。因此，睾丸间质细胞对单次热应激处理后小鼠睾丸生殖功能可逆性变化起到很重要的作用。目前，热应激后小鼠睾丸间质细胞抗凋亡机制鲜见报道。

本课题组前期研究发现，乙醛脱氢酶2(Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH2)蛋白在睾丸间质细胞中表达，其具有抗细胞凋亡的作用[6]。因此，本实验拟明确ALDH2蛋白在小鼠热应激后是否具有表达差异，探讨ALDH2在单次热应激致小鼠睾丸功能可逆性变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6周龄C57雄性小鼠(体质量为25～30 g)18只，购自宁夏医科大学动物中心(SPF级)，由滨州医学院附属医院动物中心(SPF级)提供饲养条件。

1.1.2 主要试剂 ALDH2多克隆抗体购自Abcam公司，山羊血清工作液、免疫组化试剂盒、DAB显色试剂及含DAPI抗淬灭剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，蛋白提取试剂盒等购自凯基生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 睾丸热损伤模型建立及标本制备 18只雄性C57小鼠分别按给予热应激1、7、14 d随机分为3个热应激组(n=3)和3个对照组(n=3)。腹腔注射戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉，止血钳夹住小鼠头部皮肤，待小鼠睾丸下降至阴囊，使对照组和热应激组小鼠下腹部分别浸入25℃、43℃恒温水浴15 min。并于热应激后1、7、14 d 给予戊巴比妥钠致死剂量处死小鼠，无菌低温处理小鼠睾丸，右侧睾丸置于4%多聚甲醛中固定，左侧睾丸置于-80℃冰箱中保存[4]。

1.2.2 免疫组化染色 恒温60℃烤箱烘4 h，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水；枸橼酸钠修复液抗原修复，冷却至室温，室温3%H2O2避光孵育8 min；室温山羊血清封闭30 min，滴加兔抗小鼠ALDH2多克隆抗体(1∶300)，室温孵育1 h，置4℃孵育过夜；室温孵育1 h，滴加聚合物辅助剂，37℃孵育15 min；滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG多聚体，37℃孵育25 min；显色、复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片[4]。

1.2.3 蛋白印迹检测 Western blot检测ALDH2蛋白凯基蛋白提取试剂盒提取睾丸组织蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，加上样缓冲液-80℃冻存。凝胶电泳，100 V转膜60 min，室温5%的脱脂奶粉封闭60 min；加兔抗小鼠ALDH2多克隆抗体(1∶300稀释)，摇床室温孵育1.5 h；加入山羊抗兔IgG，摇床室温孵育30 min；滴加稀释后超敏发光液、避光曝光。利用软件Image J分析蛋白光密度值。β-肌动蛋白作为内参对照，数据以ALDH2/β-肌动蛋白比值表示，实验重复3次[4]。

2 结果

2.1 ALDH2免疫组织化学检测 免疫组化结果显示，ALDH2蛋白阳性表达于睾丸间质细胞(见图1)。

2.2 ALDH2蛋白Western blot检测 与对照组相比，热应激后第1 d，ALDH2蛋白表达无明显改变；热应激组第7、14 d较对照组及热应激第1 d比较，ALDH2蛋白表达明显增加(P<0.01)；热应激第7 d与热应激第14 d，ALDH2蛋白表达无明显改变(见图2)。

3 讨论

目前世界人口已超过70亿，并且正以每年8000万的速度增长。人口无节制的增长成为环境恶化、人类贫穷的主要原因。因此，避孕的研究越来越受到人们的重视，其也成为有效控制人口增长的最重要的手段。但是到目前为止，针对男性避孕的方法少之又少，主要有避孕套和输精管结扎术等。而且，不可逆的绝育术占到了男性避孕方法的一半以上[7-8]。所以寻找安全、有效、可逆的男性避孕方法迫在眉睫。

WHO针对避孕方法提出的三大原则是：安全、有效、可逆。在临床上，有一种疾病叫“隐睾症”，即睾丸没有正常的降到阴囊留在腹部。这种疾病可以导致睾丸生殖细胞的缺失，但是如果在幼年时行手术，睾丸的生精功能是可以恢复的[7]。本课题组及其他学者前期研究发现：单次热应激后生殖细胞凋亡导致雄性小鼠生育力下降，然而这个过程是可逆性的，即其在一段时间内是可以恢复其生育能力的[4]，根据这个现象，我们是否将其完善成为男性避孕的一种措施？目前其安全性及有效性尚未明确。因此，对于其机制的研究显得越来越重要。

研究发现，生殖细胞凋亡是热应激后小鼠睾丸细胞出现的最明显的变化，在单次热应激后的第7天，生精小管中仅基底膜处残存有稀疏的散在分布的细胞，然而单次热应激后14天，生精小管中生殖细胞又开始规律排列[9]。我们发现，精原干细胞在生殖细胞再生中发挥了重要的作用，包括其干细胞增殖分化的因子[2]。同时，我们发现在单次热应激后睾丸间质细胞凋亡不明显。睾丸间质细胞主要的功能是合成和分泌雄激素，雄激素可以促进精子的产生及成熟[5]。因此，我们推测睾丸间质细胞在单次热应激后小鼠睾丸生育能力可逆性变化发挥了重要作用，但其具体机制尚鲜见报道。

本课题组前期研究发现，ALDH2蛋白在睾丸间质细胞中表达，ALDH2基因位于第12号染色体的12q24.2位置，编码由517个氨基酸残基组成的蛋白质，其位于细胞线粒体内，在抗心肌细胞凋亡方面具有显著作用[10]。本实验中，免疫组化显示ALDH2蛋白的定位主要是在睾丸间质细胞；蛋白印迹显示ALDH2蛋白的表达量在单次热应激第1天与对照组相比是没有明显变化的，而热应激第7、14天表达量是明显上升的。

研究发现，ALDH2具有抗凋亡的作用，ALDH2酶在治疗因酒精导致的细胞损伤有很大的潜力，其是急性酒精中毒的保护因子，能阻止乙醇诱导心肌细胞的凋亡、蛋白质损伤和线粒体膜电位去极化[11]。在糖尿病大鼠研究中，ALDH2可以保护心肌细胞，抑制细胞的凋亡，ALDH2受体激动剂乙醇可显著减少乳酸脱氢酶的释放和caspase-3的活性，增加ALDH2的激活和Bcl-2/Bax mRNA的表达[12]。此外，研究发现ALDH2有抵抗氧化应激的功能，ALDH2基因转染可以抵抗H2O2诱导的外周血单核细胞损伤和减缓凋亡，并伴随着细胞内活性氧的下调[13]。ALDH2转基因可以明显减缓乙醛诱导的心脏细胞的活性氧的生成，心肌细胞凋亡以及ERK1/2 和 SAPK/JNK的磷酸化[14]。

综上所述，ALDH2具有显著的抗凋亡作用，而热应激处理小鼠睾丸后，在睾丸间质中ALDH2的高表达对减少生精细胞的凋亡可能存在着某种机制的联系。然而，其具体机制仍需进一步的研究与验证。