浙江省地方鸡种禽白血病毒抗原检测与部分分离株GP85基因序列分析
2020-08-30华炯钢叶伟成朱寅初
倪 征，陈 柳，华炯钢，叶伟成，云 涛，朱寅初，张 存
(浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)
禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽白血病亚群病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的，以造血细胞恶性增生为主的一类传染病总称。根据ALV致肿瘤细胞的类型，可将该类传染病分为淋巴细胞性白血病、禽骨髓细胞性白血病、成髓细胞性白血病和成红细胞性白血病等多种[1]。ALV在分类上属于反转录病毒科，α-反转录病毒属[2]。根据病毒的宿主范围、囊膜特性、抗原差异性等特征，可将ALV分为A-J共10个亚群。其中，A-D亚群ALV为外源性病毒；E亚群ALV包括极普遍存在的低致病性或无致病性的内源性白血病病毒，其他亚群为内源性病毒。J亚群ALV是一种首次发现于英国的、新的外源性ALV[3]，其主要囊膜糖蛋白(env)的基因序列明显不同于A-I亚群，具有明显的亚群特异性。在所有ALV亚群中，J亚群的致病力最强，对禽类的威胁最大。
ALV-J在流行初期主要感染肉用型种鸡，引起以骨髓样细胞瘤为主的白血病。后来发现，蛋用型鸡也可感染ALV-J，但很少引起肿瘤[4]。值得注意的是，J亚群和B亚群的ALV发生重组时，被感染的蛋鸡可产生典型的髓细胞瘤[5]。随着我国养鸡业规模的日益扩大，我国蛋鸡群感染ALV-J的病例也在日益增加[6-7]，甚至造成地区性流行。更令人担忧的是，近年来我国特有的一些地方鸡种屡屡发生ALV-J感染疫情[7-9]。这警示我们ALV-J在我国正在从商品肉鸡、蛋鸡向地方鸡群中传播，宿主范围不断扩大。为了防止以ALV-J亚群为代表的禽白血病在我国地方鸡中继续扩散和蔓延，同时也为了保护地方鸡品种资源，有必要在地方鸡的规模养殖场中实施禽白血病毒检测，并采取必要的净化措施。鉴于此，本研究对浙江省地方级规模养殖厂中的不同品种鸡进行了抽样检测，并选择从感染率较高的地方鸡样本中进行分离和基因测序，分析它与国内其他ALV分离株，以及HPRS103原型毒株的亲缘关系，为进一步实施浙江省地方鸡群中ALV的净化提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 地方鸡样品
本研究从浙江GDZQ公司饲养的20个品系的地方鸡群中进行采样，共计采集公鸡血清样本1 939份，母鸡蛋清样本5 980份，雏鸡胎粪5 384份，备检。
1.1.2 试剂
本研究使用的禽白血病p27抗原检测试剂盒为美国IDEXX公司产品。胎牛血清(FBS)、胰酶(0.25%)DMEM细胞培养液均购自美国GIBCO公司。DF1细胞由本研究室保存。
1.2 方法
1.2.1 样品采集及处理
血清样本处理：所有血清样本均使用肝素钠真空采血管无菌采集，颠倒混匀3次后，在冷藏条件下送至实验室，2 000 r·min-1离心5 min，4 ℃保存，备检。
蛋清样本处理：蛋清用样品稀释液经500倍稀释后，4 ℃保存，备检。
胎粪样本处理：棉拭子加入1 mL样品稀释液经-70 ℃反复冻融3次后，备检。
1.2.2 p27抗原的测定
根据试剂盒使用说明书，对所有样本进行ALV p27抗原检测。
1.2.3 病毒分离和鉴定
取检测阳性的样品上清底部的白细胞200 μL接种到长满单层DF1细胞的6孔板中，37 ℃ CO2培养箱中吸附2 h，用含2%胎牛血清的细胞维持液换液，然后继续培养7 d。连续传3代。使用p27抗原检测试剂盒进行病毒检测。
1.2.4GP85基因扩增与测序
根据已发表的GP85基因序列(GenBank登录号No.Z46390)，设计1对特异性引物用于GP85基因的扩增。GP85+：5＇-GGAGTTCATCTGTTGCGA-3＇；GP85-：5＇-CGCGGATCCGCGCCTGCTACGGCGGT-3＇。预期产物长约928 bp。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性50 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳观察。并通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后与pMD19-T载体连接，然后转化至DH5α感受态细胞中，涂布氨苄抗性的LB平板。37 ℃培养过夜后挑取单菌落，通过菌液PCR筛选阳性克隆。最后，将特异性PCR产物送至测序公司进行测序。
1.2.5 测序结果与参考株的序列比对和分析
将获得的基因序列进行BLAST检索，使用DNASTAR 软件将分离毒株的GP85基因序列与已发表的 ALV 不同亚群代表株进行核苷酸同源性比较(表1)。同时，我们还运用生物信息学软件绘制了ALV-JGP85基因的系统发育树，对本文ALV-J分离株的遗传进化情况进行分析。
2 结果与分析
2.1 p27抗原检测结果
本研究对浙江GDZQ公司20个品系的地方鸡群中采集的公鸡血清样本1 939份，母鸡蛋清样本5 980份，以及雏鸡胎粪5 384份进行了p27抗原检测。结果显示，所有被检测地方鸡群都有p27抗原存在，提示在浙江的地方鸡群中有不同程度的ALV感染。其中，101系的抗体阳性率最高，母鸡阳性率为40.48%，公鸡阳性率为16.54%；126系次之，母鸡阳性率为28.87%，公鸡阳性率为3.30%；171系抗体阳性率最低，其母鸡阳性率仅为4.08%， 公鸡的感染率为0。具体检测结果参见表2。
表1 本文使用的部分参考毒株及其序列号
表2 浙江省地方鸡禽白血病检测结果统计
续表2 Continued Table 2
2.2 GP85基因PCR扩增结果
对感染率比较高的101系、118系、126系、127系和208系的样品进行细胞接种，盲传3代以后，对细胞上清进行PCR检测，结果均扩增出924 bp的特异性PCR产物，与预期一致(图1)。
M，DNA Marker；1，101系；2，118系；3， 126系; 4，127 系；5，208系；6，阴性对照。M， DNA Marker; 1， Line 101; 2， Line 118; 3， Line 126; 4， Line 127; 5， Line 208; 6， Negative control.图1 ALV-J GP85基因扩增产物Fig.1 PCR amplification of ALV-J GP85 gene
2.3 与参考株序列的同源性比较
扩增的5个品系样品的GP85基因长度均为924 bp。利用DNASTAR软件将分离株的序列与参考序列进行比对分析，结果表明，本研究测的样品序列之间的核苷酸同源性为90.8%～98.5%，与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为90.3%～97.0%，与国内其他分离株的同源性为86.5%～99.0%。分离株与福建(FJ201308株)和广东(WF13株)分离株的同源性最高(图2)。
图2 本文分离株GP85基因与国内ALV参考株的同源性比较Fig.2 Sequence comparison of GP85 gene among isolated strains and reference strains of ALV
2.4 本文ALV-J分离株的遗传进化分析
根据测定的5株ALV-J分离株的GP85基因序列以及部分国内参考株的GP85基因序列，利用DNASTAR软件构建了遗传进化树(图3)。分析表明，本文分离株之间的亲缘关系，以及与国内其他分离株之间均具有很近的亲缘关系，并处于同一大的进化分支；相比之下，它们与ALV-J原型株HPRS103的遗传距离都较远。但是，从进化角度来看，它们仍处于同一大的进化分支。
图3 根据GP85基因构建的本文分离株与其他ALV-J参考株的进化树Fig.3 Sequence comparison of GP85 gene among isolated strains and reference strains of ALV
3 讨论
禽白血病是一类对养禽业具有严重威胁的免疫抑制性传染病，迄今已经报道的ALV至少有10个亚群，按分离鉴定的先后分别定名为A-J，其中A-E和J都是从鸡中分离到的，其他亚型是从鸟类分离而来。大部分亚群的ALV对鸡的感染性和致病力并不是很强，很少有死亡现象。但是ALV-J例外，它对肉鸡、蛋鸡及其他品种的鸡均具有很强的传染性和致病性。近年来，我国学者又不断发现在地方鸡群中也存在感染现象[10-13]，提示我们要尽快实施禽白血病的净化工作，以保障我国养禽业的健康发展以及我国特有的地方鸡资源。
本研究对浙江省部分地方品种鸡体内的ALV的p27抗原进行了检测，从疑似感染鸡群中检测中分离到5株ALV-J，并对其GP85基因进行PCR分子克隆和序列分析。研究结果显示，在检测的19个地方鸡品系中，所有品系的鸡样本都呈现抗原阳性，其中101系的抗体阳性率最高，母鸡阳性率为40.48%，公鸡阳性率为16.54%；126系次之，母鸡阳性率为28.87%，公鸡阳性率为3.30%；171系抗体阳性率最低，其母鸡阳性率仅为4.08%，公鸡的感染率为0。为了解地方鸡群中ALV-J的遗传变异，本研究对分离到的5株ALV-J的GP85基因进行了分子克隆和序列分析。结果表明，5个分离毒株的GP85基因大小均为924 bp，与预期一致；本研究测的样品序列之间的核苷酸同源性为90.8%～98.5%，与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为90.3%～97.0%，与国内其他分离株的同源性为86.5%～99.0%。分离株与福建(FJ201308株)和广东(WF13株)分离株的同源性最高。结果表明，浙江省大部分地方品种鸡都不同程度感染ALV-J，而且分离毒株已经发生了不同程度的变异，提示我们应加强浙江省地方品种鸡ALV的净化工作。
