基于高肥力设施土壤蔡-18菌液替代化肥对黄瓜生长与土壤生态的影响

杨小玲，仝雅娜，华明艳，宋兰芳，马洪英，张淑香

(1.天津农业科学院，天津 300192；2.中国农业科学院 农业资源与农业区划研究所，北京 100081)

为追求高产高效，设施蔬菜复种指数高和施肥过量等问题普遍存在，多数设施土壤已出现了不同程度的酸化或次生盐渍化现象，生态平衡受到严重的破坏，同时也诱导了病虫害频发，使产品产量和品质下降[1-3]。王丽英等[4]调研设施蔬菜肥料管理现状时发现，尽管我国多省市的设施蔬菜土壤中普遍存在盐渍化和板结等问题，但生产中仍采用盲目施肥方式，使施肥量远远超过蔬菜的养分吸收量[5]。因此，开展不同养分水平的土壤施肥技术研发和推广，推动化肥零增长工作，对于提高我国土壤质量综合管理水平，保障设施土壤的可持续生产具有重要意义。在农作物单位面积化肥施用量上，黄瓜排列第三[6]，所以在设施黄瓜生产中如何合理施肥值得我们进行研究。

土壤微生物是土壤生态系统中的重要组成部分，也是衡量土壤质量的重要指标[7]。随着土壤环境破坏和污染问题的日益突出，微生物菌剂的研究与应用成为当前热点之一。在功能上，微生物菌剂可分为拮抗病菌型、促生型和分解养分型的3种类型[7-8]。研究表明，微生物菌剂具有提高土壤肥力、增加土壤微生物菌群数量、抑制病原菌繁殖、增强植株抗病性、增产提质等作用[9-11]。在应用方法上，主要有菌剂发酵有机肥形成微生物有机肥用作基肥、固态菌剂基施定植穴、化肥与菌液配合施用以及叶面喷施发酵活性菌液4种方法，有关在高肥力土壤用微生物菌液替代化肥进行追肥的生产实践鲜有报道。蔡-18菌是放线菌、酵母、芽孢菌杆菌、醋酸杆菌等组成的复合菌群，是引进台湾中兴大学蔡东纂教授研发了18 a的菌种(称蔡-18菌)，本研究在土壤肥力高(有机质54.9 g/kg、有效磷574.05 mg/kg、速效钾1 161.3 mg/kg)的温室中，研究蔡-18菌发酵液替代化肥追肥对黄瓜产量、品质和根际微生物菌群结构、土壤养分的影响，以期为老菜田土壤的修复和减肥生产技术提供方法，保障设施土壤的可持续发展。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验品种为德瑞特种业有限公司的博耐30油亮型黄瓜。

蔡-18菌液是天津设施农业研究所葡萄中心从台湾中兴大学引进，以豆浆为有机载体经过菌种扩繁与发酵形成，经检测，发酵液pH值4.12，有效活菌数﹥1×108个cfu/mL，游离氨基酸181.11 μmol/L、有机质1.24%、全氮0.39%、全磷0.12%、全钾0.14%，以及多胺类物质3 078 ng/mL，IAA 784 ng/mL、GA33.8 ng/mL、ABA 3.3 ng/mL等次生物代谢产物等多种营养物质。

化肥为烟台浩林生物肥料有限公司销售的贵和大量元素水溶肥(N∶P∶K=20∶20∶20)和以色列海法保力丰2号水溶性肥(N∶P∶K=16∶8∶34)。

1.2 试验设计

试验在天津市武清区现代农业创新基地日光温室内进行，该温室已经连续种植番茄与黄瓜6 a，为2 a轮作一次。种植前施用有机肥37.5 t/hm2，施有机肥后旋地做畦，随机采取试验地土样，分析土壤养分。其中全氮：3.91 g/kg，全磷：2.80 g/kg，全钾：18.38 g/kg，水解氮：283.55 mg/kg，有效磷：574.05 mg/kg，速效钾：1161.3 mg/kg，有机质为54.9 g/kg。

3月1日定植，行株距为90 cm×30 cm，4月1日始收黄瓜，并在采收后第一次追肥，7月16日拉秧。全生育期采用滴灌浇水，3月份每3～4 d浇一次水，4月份以后每2～3 d浇一次水。7～10 d随浇水追肥。

田间设置3种追肥处理，处理1：滴灌追施水溶性肥(WSF)，全生育期追施1 275 kg/hm2水溶性肥，其中贵和大量元素水溶肥(N∶P∶K=20∶20∶20)213 kg/hm2，以色列海法保力丰2号高钾肥(N∶P∶K=16∶8∶34)1 062 kg/hm2，经计算，纯N用量为212.7 kg/hm2，P2O5用量93.6 kg/hm2，K2O用量 363.3 kg/hm2。处理2：滴灌追施蔡-18菌液(Cai-18)，全生育期共施3.552 m3/hm2，根据菌液营养成分含量分析，追施纯N用量为13.85 kg/hm2，P2O5用量4.26 kg/hm2，K2O用量4.97 kg/hm2。处理3：对照(CK)，不追施肥料及其他物质，仅浇水。每处理重复3次，区组随机排列，小区面积26.72 m2。

1.3 试验方法

Miseq高通量技术分析根际土壤微生物多样性：随机收集黄瓜拔秧后根系新鲜土壤样本，送北京奥维森基因科技有限公司分析根际微生物的多样性。土壤样本通过DNA提取、扩增16S V3-V4和ITS1区域PCR扩增、荧光定量、Miseq文库构建和Miseq上机测序、对原始数据进行过滤处理后进行序列拼接，得到优化序列后去除嵌合体序列，然后进行97%序列相似度OTU聚类分析，用Alpha多样性指数分析样本的种群丰度、多样性，并计算不同菌群的相对含量。

土壤养分分析：定植之前随机采取0～20 cm混合土壤样品和拔秧后随机采取植株生长位置0～20 cm的混合土壤样品，送天津市农业资源与环境研究所土壤养分分析中心测定。有机质含量采用重铬酸钾-硫酸加热消化法测定；用浓硫酸消化-凯氏定氮法测定全量氮，氢氧化钠碱融、钼蓝比色法测定全磷和火焰光度计测定全钾；采用扩散吸收法测定水解氮，采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-硫酸钼锑抗比色法测定有效磷，采用1 mol/L NH4OAC浸提-火焰光度计法测定速效钾[12]。

果实质地测定：每处理每次重复取6根黄瓜，取果实中段用TA.XT.Plus质构仪测定果实弹性、果皮硬度、果肉硬度等质地性质。果实可溶性糖用蒽酮法测定[13]。

果实香气测定：采用气相色谱-质谱仪(GC-MS)法测定，利用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GCMS) 分析。所用试剂为无水乙醇和2-辛醇。GC-MS色谱条件：载气(高纯氦气)纯度≥99. 999%，流速1.0 mL/min，分流比为5∶1；升温程序：35 ℃保持 2 min，以4 ℃/min 升至 200 ℃，以30 ℃/min 升至250 ℃，保持5 min；进样口温度：250 ℃。质谱检测条件：离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；电子轰击源70 eV；扫描范围30～300 amu。定性分析：对检测的挥发性成分通过未知物分析软件(美国 Agilent 公司)与 NIST 11． L谱库(美国Agilent 公司)提供的标准谱图进行匹配，如果匹配因子大于80(最高 100)，通过相同GC-MS 条件下标准品的保留时间和质谱图进一步比对确认。香气相对含量=单个物质峰面积×100%/峰总面积。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel对数据进行统计与绘图，用SPSS 19.0数据处理软件进行统计分析、LSD进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对黄瓜产量的影响

从表1可以看出，对照CK在黄瓜生长期间没有投入肥料，但收获黄瓜产量106.6 t/hm2，表明土壤肥力高；WSF和Cai-18 2种处理之间产量差异不显著，比CK分别提高了6.21%和6.59%，达到了5%显著差异水平。根据Cai-18菌液和WSF所含N、P、K含量计算，Cai-18处理氮、磷、钾的用量比WSF处理分别减少了93.48%，95.44%，98.63%。按每1 000 kg黄瓜计算，WSF处理氮、磷、钾用量分别是Cai-18处理的15.4，21.8，73.0倍。Cai-18处理施入土壤的氮、磷、钾含量极少，但其产量与WSF处理无显著差异。因此，在高肥力土壤，Cai-18菌液具有较好的增产作用。

表1 不同处理纯N、P、K施用量和黄瓜产量Tab.1 Pure N，P and K application amount and cucumber yield in different treatment

2.2 不同肥料处理对黄瓜品质的影响

从表2可以看出，不同处理的黄瓜果皮硬度、果皮韧性和果肉硬度、果肉粘附性等质地指标差异不显著，但CK的可溶性糖含量显著低于其他2种处理。

图1表明了3种处理的果实香气成分，3种处理在24 min前峰值差别不明显，24 min后有一定的差别。酯类物质是香气主要成分之一，WSF处理在24 min后出现2种酯类物质，其他2种处理分别检出4种酯类物质，但4种酯类物质不完全相同。在相对含量上，Cai-18处理的酯类物质相对含量分别是WSF、CK处理的1.69，1.50倍。3种处理在27～28 min均出现了半萜类香气物质蛇麻烯(Humulene，C15H24)，WSF和Cai-18处理的相对含量分别为0.012%和0.013%，是CK的1.4倍。

Cai-18处理的黄瓜可溶性糖含量较高，酯类香气物质多，酯类和半萜类香气物质的相对总含量最高，口感风味好。因此，Cai-18菌液提高了黄瓜品质。

表2 不同肥料处理对黄瓜品质的影响Tab.2 Effect of different fertilizer treatments on cucumber quality

图1 不同肥料处理对黄瓜香气物质的影响Fig.1 Effect of different fertilizer treatments on aroma substances of cucumber

2.3 不同处理对根际土壤细菌菌群丰富度、多样性与结构均衡性的影响

Miseq高通量技术分析3种处理根际土壤细菌菌群多样性指数见表3。OTU分组数以序列97%相似度分为一组，Chao 1指数、Shannon指数越大表明菌种丰富度和群落多样性越高。从表3可以看出，不同处理土壤样本的细菌样品库覆盖率在98%～99%，被测出细菌的碱基序列很高。3种处理的OTU分组数、Chao 1和Shannon指数比较：Cai-18处理>CK>WSF处理，但差异不显著。因此，Cai-18菌液处理可提高根际土壤细菌菌群的丰富度和菌落多样性，土壤微生物向“细菌型”转化。

施肥影响根际土壤细菌不同菌群的相对含量。从表4可以看出，根际土壤细菌菌群在门分类水平上，按菌群丰富度分成5类，分别为优势菌群(>35%)、大量菌群(11%～30%)、中量菌群(5%～10%)、少量菌群(1%～4%)和其他微量菌群(<1%)。在优势菌群上，CK的变形菌门(Proteobacteria)相对含量显著高于WSF处理，Cai-18处理与其他2种处理差异不显著。在大量菌群上，WSF处理的酸杆菌门(Acidobacteria)相对含量显著高于其他2种处理。Miseq高通量微生物多样性分析将介于细菌和丝状真菌而更接近细菌的放线菌原核微生物划分为细菌类型，因此中量菌群包括绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)4种菌群。Cai-18处理的中量菌群相对含量总和比WSF处理和CK分别高11.45，8.48百分点，其中，绿弯菌群含量显著高于其他2种处理，拟杆菌群含量显著高于WSF处理，与CK差异不显著；在具有抗病特性的菌群上，WSF处理的放线菌群含量显著低于其他2种处理，芽单胞菌群相对含量差异不显著。少量菌群包括4种菌群，3种处理的少量菌群相对含量总和分别为6.6%，4.5%，4.8%，没有显著差异，且除厚壁菌外单个菌群之间的相对含量也没有显著差异。3种处理的其他微量菌群相对含量在2.37%～2.64%，差异也不显著。因此，追施Cai-18生物菌液可以降低根际大量菌群的含量，提高中量菌群含量，使门分类水平上的菌群数量结构均衡。CK优势菌群含量过多，菌群的数量结构均衡性比Cai-18处理差。

表3 不同处理对根际土壤细菌丰度和多样性的影响Tab.3 Effect of different treatments on bacterial abundance and diversity in rhizosphere soil

表4 不同处理根际土壤门分类水平不同细菌菌群相对含量 Tab.4 Relative content of bacterial flora at phylum-level of rhizosphere soil in different treatments %

2.4 不同处理对根际土壤真菌丰富度、多样性与均衡性的影响

不同处理对根际土壤真菌多样性指标影响见表5。由表5可见，OTU分组数为WSF处理>CK>Cai-18处理，Chao 1指数WSF处理最高，其次为Cai-18;Shannon指数为CK>WSF处理>Cai-18处理，但各指标在处理间差异均不显著。因此，WSF处理和CK的根际土壤真菌丰富和多样性比Cai-18处理高，进一步表明施用蔡-18菌剂土壤微生物向“细菌型”优化。

在门分类水平上，3种处理根际土壤检测出6类真菌菌群。其中，子囊菌门(Ascomycota)占89%以上，其他5种菌群相对含量均<5%，很难判断不同处理根际土壤真菌菌群在数量结构上的差异。在目分类水平上，3种处理分别检测出23，22，23个目分类级菌群。从表6可以看出，根际土壤的真菌菌群以粪壳菌目(Sordariales)为主，WSF处理显著提高粪壳目菌群数量，其相对含量超过总数的50%；肉座菌目(Hypocreales)是根际土壤的第二大类菌群，Cai-18处理的相对含量比其他2种处理高，但差异不显著。WSF处理和Cai-18处理的其他菌群相对含量均低于10%，其中，WSF处理后相对含量在5%～10%的菌群有2种，Cai-18处理有3种。CK不同菌群相对含量较均衡，粪壳菌目数量最多，其相对含量不足28%，相对含量10%～20%的菌群有3种，5%～10%的菌群也有3种。说明CK真菌菌群数量结构均衡性>Cai-18处理>WSF处理。

因此，追肥降低根际土壤真菌数量结构的均衡性，但追施Cai-18菌液比追施化肥均衡性更好。

2.5 不同处理对土壤养分含量的影响

从表7可以看出，在多年培肥和施肥条件下，连续种植6 a果类蔬菜设施土壤养分含量大幅度增加，其中土壤有机质含量是大田土壤(建造温室前)的2.97倍，水解氮、有效磷、速效钾含量分别是大田土壤的4.8，133.8，4.4倍，有效磷和速效钾的含量已远远超出了蔬菜正常生长的土壤养分参考值，表明当前设施蔬菜施肥过量和设施土壤养分状况失衡的现象十分严重，需要改善现有的施肥模式。

表5 不同处理对根际土壤真菌丰度和多样性指标的影响Tab.5 Effect of different treatments on fungi abundance and diversity in rhizosphere soil

表6 不同处理目分类水平不同真菌菌群相对含量Tab.6 Relative content of fungi flora at order-level of rhizosphere soil in different treatments %

由表7可知，在氮、磷、钾养分富积的土壤上生产单季黄瓜(135 d)，与定植前土壤养分相比，3种处理根际土壤的全钾、全磷含量变化不显著，而全氮、水解氮、有效磷、速效钾和有机质含量显著下降，其中，水解氮降幅30%左右，有效磷降幅49%～59%，速效钾降幅29%～54%。不同处理间的全氮、水解氮和有机质含量差异不显著，而有效磷和速效钾含量差异显著，其中，CK有效磷和速效钾含量比其他2个处理分别低24.30，33.4 mg/kg和285.70，144.85 mg/kg，达到了显著差异水平；WSF处理和Cai-18处理有效磷含量差异不显著，但前者速效钾含量比后者高140.85 mg/kg，达到5%的显著水平。

表7 不同处理对土壤养分含量的影响Tab.7 Effect of different treatments on soil nutrient content

3 讨论与结论

土壤微生物群落的变化不仅受地上部植物种类、品种、气候条件的影响，也受地下管理措施的影响[14]。秦越等[15]研究表明，随着马铃薯连作年限的增加，根际土壤细菌多样样水平降低，真菌多样性水平升高，土增微生物生态环境恶化。吴斌等[16]发现，小麦黄花叶病毒病发病严重地块的真菌种类增加。长期施用微生物发酵的有机肥可改善土壤理化性状，提高土壤中速效养分含量，增加土壤微生物数量和酶活性，特别是增加有益菌数量，抑制病菌繁殖[9，17]。陈文等[18]研究表明，施用生物有机肥或EM菌剂配施化肥比施纯化肥的土壤微多样性更高、均一度更好。本研究结果表明，追施蔡-18生物菌液提高根际土壤细菌的丰富度和多样性，降低真菌的丰富度和多样性，且菌群数量结构的均一度得到了较好的改善，促进土壤微生物向“细菌型”土壤优化。李维炯[19]、杨宇虹等[20]认为施生物菌肥提高土壤放线菌含量，与本研究追施蔡-18菌液所获得的结果一致；杨宇虹等[20]认为追施化肥的土壤放线菌含量比不施肥处理高，而本研究不追肥处理比追施化肥处理的土壤放线菌含量提高38%，达到了显著差异。因此，追施蔡-18菌液改善了根际土壤微生物生态环境。

当土壤有机质>30 g/kg、碱解氮>160 mg/kg、有效磷>130 mg/kg、速效钾>250 mg/kg时，土壤被视为高肥力水平[21-22]。肖国胜等[23]认为土壤有效磷含量>130 mg/kg时，蔬菜生产当季可以不施无机磷肥。赫新洲等[24]认为土壤速效钾含量大于225.4 mg/kg时，不施钾肥不会降低菜心的产量。本研究的土壤有效磷、速效钾含量分别是高肥力土壤推荐值的4.4，4.65倍，尽管没有追化肥或生物菌液可收获106.6 t/hm2的产量，但仍显著低于施化肥处理和施生物菌液处理的产量。杨猛等[25]研究表明，EM菌堆肥可提高黄瓜根系鲜质量、侧根数和根系活动。本研究经检测到，蔡-18菌发酵液含有游离氮基酸、植物激素和精胺、亚精胺、腐胺类物质等营养成分，这些物质具有促进根系和植株生长的作用。笔者认为追施蔡-18菌液可通过菌液中的营养物质刺激植株根系生长旺盛，形成根深苗壮的生长态势，不仅能吸收表层土壤的矿质营养，而且能利用深层土壤矿质营养；同时，蔡-18菌发酵液含有多种活性功能菌和有机酸(pH值4.12)，均有溶磷解钾的作用，使根区有效磷和速效钾含量增加；不追肥对照处理根系较浅，所吸收的矿质营养主要来自表层0～20 cm土壤，这可能是导致了不追肥对照处理0～20 cm土壤有效磷和速效钾含量显著低于追施蔡-18菌发酵液处理，具体原因有待进一步验证。

黄瓜盛瓜期营养生长与生殖生长同时进行，需肥量较大，当植株生长期达100 d左右，根系开始逐渐衰退，根量减少，此时养分不足极易导致植株早衰。笔者认为少量多次追施化肥，特别是结瓜后期及时追肥或补充功能性营养可以促进根系生长，防止植株早衰，提高产量。本试验在盛瓜后期将追施化肥处理的高钾肥(N∶P∶K=16∶8∶34)改为追施平衡肥(N∶P∶K=20∶20∶20)1～2次，以提高肥料氮、磷含量，促进根系的生长，防止早衰。而蔡-18菌发酵液中含有促根生长所需的功能营养，如氨基酸181.11 μmol/L、多胺类物质3 078 ng/mL、IAA 784 ng/mL、GA33.8 ng/mL等，也可较好地促进根系生长与更新，使之达到防止早衰、提高产量的目的。杨猛等[25]研究表明，施用EM菌发酵有机肥能显著提高大棚黄瓜产量和果实VC含量，但不影响可溶性糖含量。张敏硕等[26]研究表明，微生物菌剂显著提高马铃薯VC、可溶性蛋白和可溶性糖含量，改善品质。张佼等[27]研究表明，有机肥+复合肥+微生物菌剂可以增强土壤肥料利用率，促进番茄光合作用及干物质积累，最终提高果实产量和品质(果实可溶性总糖、维生素C、还原糖质量分数分别提高62.50%，21.30%，97.31%)。本研究从影响黄瓜口感的质地指标和香气味觉指标研究蔡-18菌发酵液对黄瓜品质的影响，结果表明，追施菌发酵液后果实的可溶性糖、香气成分及其含量提高，产量与追施化肥效果相同。笔者在金蜜龙甜瓜生产中进一步验证了追施蔡-18菌发酵液具有增产提质的作用，所获得的结论与黄瓜一致。

综合而言，在肥力高的土壤中追施蔡-18菌液改善根际土壤微生物生态环境，缓解过量施肥导致的根区土壤养分状况失衡问题，营造根系良好的生态环境，提高作物产品品质与产量。因此，在高肥力设施土壤生产两茬蔬菜，推荐至少可以有一茬蔬菜生产用蔡-18菌液替代化肥进行追肥。