miR-21对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

马灵芝， 施娇壮， 戈文斌， 张琨， 余兵， 刘亚丽

昆明医科大学附属口腔医院口腔正畸科，云南 昆明（650101）

人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）是牙周组织中修复和再生重要的细胞群，因其具有免疫调节特性，且可以分化成为不同的细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞等，而被认为是牙周炎治疗的最有潜力的种子细胞。微小RNA（microRNA，miRNA）是18～25 个核苷酸组成的非编码、高度保守的RNA，因其在细胞分化、凋亡、增殖及迁移等多种过程中的作用而受到广泛关注［1］。有报道miRNA 在牙周炎的发生发展和宿主免疫发挥重要作用［2-3］。研究发现在牙周炎患者的血清miRNAs 表达谱中，miR-21 表达量异常，提示miR-21 作为关键miRNA 参与牙周炎的发生发展［4］。此外，有学者发现［5］，miR-21 可以作为牙周炎控制的干预靶点，抑制牙周炎症。但miR-21 在牙周骨再生方面的研究较少，因此，本实验通过研究miR-21 对牙周膜干细胞增殖和分化的影响，旨在为牙周炎的治疗提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

α-MEM 培养基（Hyclone，美国），胎牛血清（四季青，中国），PBS（Hyclone，美国），青霉素、链霉素（Gibco，美国），0.25%胰蛋白酶（Gibco，美国），Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国），细胞周期检测试剂盒（Sysmex，日本），CCK-8 试剂盒（诺唯赞，中国），CD34（PE 标记）、CD45（PE 标记）、CD90（FITC标记）、CD105 抗体（FITC 标记），兔抗人Runx2 抗体（Abcam，美国），鼠抗兔荧光二抗（Proteintech，美国），成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒（Cyagen，美国），CO2培养箱（Thermo，美国），倒置相差显微镜以及照相系统（Olympus，日本），流式细胞仪（Partec，德国）、pre-miR-21 及其阴性对照pre-miR-21-NC，anti-miR-21 及其阴性对照anti-miR-21（锐博，中国），实时荧光定量PCR 仪（安捷伦。美国）。

1.2 hPDLSCs 的分离培养、鉴定

经患者知情同意，昆明医科大学附属口腔医院伦理委员会批准同意，收集因正畸治疗需要拔除的健康前磨牙，患者年龄为12～16 岁。酶解组织块法分离培养hPDLSCs，原代培养至细胞汇合达70%时，进行传代培养。取P3 代hPDLSCs，含2%胎牛血清的PBS 洗涤两次，调整细胞浓度为1 × 105个/mL，加入PE 标记的CD34、CD45 和FITC 标记的CD90、CD105 的抗体，避光4 ℃孵育30 min，含2%胎牛血清的PBS 洗涤两次，加入1 mL 的含2%胎牛血清的PBS 重悬，流式细胞仪上机检测进行鉴定。

1.3 细胞转染

待细胞融合至70%后，更换为不含青链双抗的α-MEM 培养基过夜培养，次日使用Lipofectamine 2000 进行pre-miR-21 及anti-miR-21 转染。pre-miR-21 为miR-21 模 拟 物，化 学 合 成 的 成 熟miRNA 双链，模拟天然存在的miRNA；anti-miR-21 是miR-21拮抗物，为化学修饰的成熟miRNA 互补单链，构建时，与成熟体序列的互补，参与抑制内源性miRNA的表达。实验分组为过表达组（mimics 组）、过表达阴性对照组（mimics-NC 组）、抑制组（inhibitor组）、抑制阴性对照组（inhibitor-NC组）。转染后24 h，实时荧光定量PCR 检测转染效率，引物序列参见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 hPDLSCs 细胞增殖检测

1.4.1 CCK-8 检测 0.25%胰酶消化P3 代hPDLSCs，将细胞以每孔4 × 103个接种于96 孔板中，进行miR-21 及anti-miR-21 的转染，实验分组：过表达阴性对照组（mimics-NC 组）、过表达组（mimics组）、抑制阴性对照组（inhibitor-NC 组）、抑制组（inhibitor 组）。分别在转染后1、2、3、4 d，酶标仪测定在450 nm 波长处的吸光度。每组设5 个复孔，实验重复3 次。具体操作参照CCK-8 试剂盒说明书。

1.4.2 细胞周期检测 转染48 h 后，0.25%胰酶分别消化各组细胞，离心弃上清，加入1 mL 的细胞周期检测Buffer（试剂盒为一步法检测细胞周期），流式细胞仪上机检测。

1.5 hPDLSCs 成骨向分化检测

1.5.1 茜素红染色 转染后24 h，开始加入成骨诱导液（含地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、谷氨酰胺的成骨诱导分化基础培养基），每隔3 d换液1次，镜下观察到矿化结节后改为半定量换液，至21 d 时，PBS 洗2 次，4%多聚甲醛固定30 min，加入茜素红染色3 min，PBS 洗2 次，镜下观察矿化结节。

1.5.2 Western blot 检测成骨相关蛋白Runx2 在成骨诱导7 d 后，提取蛋白并测定浓度。行SDSPAGE 电泳，半干法转膜，10%脱脂奶粉封闭2 h，加一抗，4 ℃孵育过夜，加二抗孵育，TBST 洗膜，条带显影及凝胶图像分析。

1.6 统计学方法

使用SPSS 18.0 统计学软件分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析和两样本独立t检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hPDLSCs 的原代培养和鉴定

原代细胞在培养7 d 左右爬出，细胞形态为长梭形。传代后的hPDLSCs 生长状态良好，呈典型的旋涡状生长（图1）。

Figure 1 Primary culture of hPDLSCs图1 hPDLSCs 原代培养

经流式细胞仪检测表面分子发现，所培养的hPDLSCs 低表达造血干细胞表面标志物CD34（1.51%）、CD45（1.01%），高表达间充质表面标志物CD90（94.16%）、CD105（98.33%）（图2）。

Figure 2 Surface molecules of hPDLSCs were measured by flow cytometry图2 流式细胞仪检测hPDLSCs 表面标志物

2.2 转染后miR-21 mRNA 的表达

转染后24 h，通过qRT-PCR 检测hPDLSCs 中miR-21 的mRNA 表 达 水 平，mimics 组 明 显 高 于mimics-NC 组，而inhibitor 组的表达明显低于inhibitor-NC组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）（图3）。

Figure 3 Relative expression of miR-21 in transfected hPDLSCs detected by qRT-RCR图3 实时定量PCR 检测转染后miR-21 mRNA 的表达

2.3 hPDLSCs 增殖检测

2.3.1 CCK-8 检测 hPDLSCs 的增殖经酶标仪检测OD 值发现，48、72、96 h 时，与mimics-NC 组相比，mimics 组细胞增殖明显增加（P＜0.01），与inhibitor-NC 组相比，inhibitor 组细胞增殖明显减少（P＜0.05）（图4）。

Figure 4 Proliferation of hPDLSCs after overexpression and inhibition of miR-21图4 miR-21 过表达及抑制后hPDLSCs 的增殖能力

2.3.2 hPDLSCs 细胞周期检测 经流式细胞仪检测发现（图5），mimics 组S 期细胞比例为（14.67 ±0.14）%，较mimics-NC 组（10.84 ± 0.64）%明显增加（t＝10.127，P＜0.01），与inhibitor-NC 组S 期细胞比例（11.72 ± 0.57）%相比，inhibitor 组S 期细胞比例（7.35±0.36）%明显减少（t＝-11.334，P＜0.05）。

Figure 5 Cell cycle of hPDLSCsafter overexpression and inhibition of miR-21图5 miR-21 过表达及抑制后hPDLSCs 的细胞周期

2.4 hPDLSCs 成骨向分化的检测

2.4.1 茜素红染色 茜素红染色后，孔板照肉眼观，mimics 组的显色度明显高于mimics-NC 组，inhibitor组显色明显低于inhibitor-NC 组；在倒置显微镜下观察，mimics 组的矿化结节明显多于mimics-NC 组，inhibitor组矿化结节明显少于inhibitor-NC组（图6）。

2.4.2 Western blot 检测成骨相关蛋白Runx2 成骨诱导7 d 后，通过Western blot 检测成骨相关蛋白Runx2 蛋白表达水平，mimics 组明显高于mimics-NC 组（t＝12.798），而inhibitor 组的表达明显低于inhibitor-NC 组（t＝-12.098），差异具有统计学意义（P＜0.05）（图7）。

Figure 6 Images of mineralized nodules by alizarin red staining after overexpression or inhibition of miR-21 in the 4 groups图6 miR-21 过表达或抑制后4 组矿化结节茜素红染色图片

Figure 7 Protein expression of Runx2 after overexpression or inhibition of miR-21图7 miR-21 过表达或抑制后Runx2 的蛋白表达情况

3 讨 论

牙周炎是发生在牙齿支持组织、与免疫相关的一种慢性炎症破坏性疾病。目前对于牙周炎的治疗包括药物治疗［6］、手术治疗以及牙周基础治疗，但均只能控制炎症，不能对于已经缺损的牙周组织进行修复和再生［7］。因此，控制已有炎症恢复缺损的牙周组织成为牙周炎治疗的研究难点。牙周膜干细胞是牙周组织来源的间充质干细胞，具有自我更新、多向分化和免疫调节的特性，且在维持牙周内环境稳定方面具有重要作用。研究发现［8］，在小型猪牙周炎模型中，使用小型猪自体PDLSCs 治疗牙周缺损，PDLSCs 能够成骨向分化，再生牙周组织。因此干细胞治疗作为一种新的、可行的临床治疗手段，为炎症破坏性疾病提供新的治疗思路［9］。

miRNAs 是一类在哺乳动物中高度保守的、非编码蛋白质的RNA，其能通过与靶基因的3`非编码区（3′UTR）碱基配对，引起mRNA 的直接降解或翻译受到抑制，从而参与细胞的基本生物学过程，如分化、增殖与凋亡［10］。此外，每一个miRNA 可能同时调控多个基因的表达。miR-21 位于17 号染色体，其全长22nt，由于其在多个肿瘤细胞中高表达，又被称为oncomiR［11-12］。近年研究发现，miR-21能通过多种信号途径参与调控干细胞的自我更新和分化［13-14］。Chen 等［15］发现阻断小鼠肉芽组织中皮肤干细胞miR-21 的表达，可以抑制细胞迁移和分化，但仍有部分细胞通过ROS 依赖途径促进增殖和自我更新；Trohatou 等［16］证实miR-21 通过调节Sox2 而参与间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的增殖和分化；Zhang 等［17］发现miR-21 促进人羊膜间充质干细胞（human amniotic membranemesenchymal stem cells，hAM-MSCs）的增殖；在去卵巢小鼠的骨质疏松模型中［18］，miR-21 的表达、骨钙素浓度和碱性磷酸酶活性下降；杨楠［19］发现miR-21 靶向Sprouty 1 参与骨髓间充质干细胞的成骨分化。以上提示，miR-21 是参与细胞增殖和分化的关键miRNA。Runx2 是骨特异性转录因子，在促进成骨分化中发挥重要作用，其表达量可反映向成骨细胞转化的趋势。此外，Runx2 的蛋白水平又受miRNA 调控［20］，miR-21 作为一种潜在的促成骨调节因子，参与调节Runx2 的转录活性［21］。本研究结果显示，miR-21 对Runx-2 有正向调控作用。Xing等［22］发现脂质体转染法对细胞损伤小、无免疫反应、操作简单、重复性高。因此，本实验采用脂质体转染法，使用Lipo 2000 转染pre-miR-21 及antimiR-21 至hPDLSCs，调高/降低hPDLSCs 中miR-21的表达。通过qRT-PCR 检测miR-21 的转染效率，排除转染试剂等对实验的干扰。通过CCK-8、流式细胞术检测细胞增殖、周期，发现miR-21 能够促进hPDLSCs 的增殖，与Zhang 等［17］研究一致；通过茜素红和Western blot 检测成骨分化能力，发现miR-21 正向调控hPDLSCs 的成骨向分化，这与杨楠［19］发现miR-21 参与MSCs 的成骨分化趋势一致。综上，本研究发现miR-21 能够显著调控hPDLSCs 的增殖和成骨向分化，但对于其作用的重要靶点及可能通路仍不明确，后续实验将进一步深入研究。