高良姜素对肝癌细胞抑制作用的机制

李 程， 张惠文， 容鹏飞

中南大学湘雅三医院 放射科， 长沙 410013

肝细胞癌(以下简称肝癌)是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，居全部恶性肿瘤死亡率第4位[1]。其治疗手段包括手术切除及肝移植、肝动脉化疗栓塞术、放疗、靶向治疗和免疫检查点抑制剂等，然而迄今为止每种方法的疗效均有局限性且预后欠佳，因此，临床上有必要寻找治疗肝癌的新方法，以提高患者治疗后的生存率，克服现有肝癌的临床治疗瓶颈。

高良姜素是姜科植物高良姜根中的提取物，其主要化学成分为黄酮，是一种多元酚化合物[2]。相关研究[3-5]证实，高良姜素能够在一定程度上抑制肿瘤细胞的活性，对机体形成保护，修复相关致癌因素所导致的细胞损伤，抑制肿瘤细胞的增殖与转移。近期研究表明，其对肝癌细胞的抑制作用较好。其机制主要与抑制增殖[6-8]、促进凋亡[9-16]、诱导自噬[17-21]和抑制转移[22-23]有关。在此，简要回顾已证实的高良姜素对肝癌细胞抑制作用的机制(图1)，并对未来可能的研究方向作出展望。

1 抑制肝癌细胞增殖

糖酵解对肝癌细胞的代谢和增殖作用至关重要。在氧气充足的情况下，正常细胞的糖酵解活性被抑制，而肿瘤细胞的糖酵解仍活跃，这种有氧糖酵解的代谢特征称为Warburg效应，在此过程中，肿瘤细胞更多的摄取葡萄糖，并将其转化为乳酸。Warburg效应能够帮助肝癌细胞适应肿瘤代谢中增高的能量需求，有利于肝癌细胞在血供相对不足的状态下继续生存并促进局部的肝癌细胞增殖[6]。有文献[7]报道，高良姜素在65、130和260 μmol/L浓度下分别抑制HepG2、HepB3和PLC/PRF/5肝癌细胞的增殖，其是通过逆转Warburg效应所实现。丙酮酸激酶是糖酵解最后一步的关键酶，它不可逆地催化磷酸烯醇丙酮酸生成烯醇式丙酮酸，其包括两种亚型，即丙酮酸激酶同工酶M1(PKM1)和M2 (PKM2)。PKM2通常在癌细胞中表达，参与糖酵解和细胞增殖，帮助肿瘤适应营养环境的变化。PKM2有高酶活性和低酶活性两种状态，低活性者在细胞恶性转化时升高，致乳酸产量增多、耗氧量减少。在高良姜素处理的肝癌细胞中，丙酮酸激酶活性显著增加，PKM2表达下调，而PKM1表达上调，同时乳酸产量降低，耗氧量增加，糖酵解受到抑制。

β-catenin是一种细胞间黏附蛋白，它在细胞形态和分化、运动和迁移、增殖和凋亡等方面发挥重要的作用。β-catenin参与人体轴向发育以及各器官的成熟过程。2011年Gwak等[8]发现高良姜素通过促进β-catenin降解，使肝癌细胞停滞在细胞周期的G0/G1期，从而抑制了细胞增殖，该研究报道进一步证实了高良姜素通过促进肝癌细胞内β-catenin蛋白降解而产生了抑癌作用。

2 促进肝癌细胞凋亡

细胞凋亡是指细胞发生自身程序性死亡的过程，其主要特征有线粒体发生功能性障碍、细胞内质网应激以及细胞周期阻滞等，其形态学特征为膜泡化、细胞质和细胞核收缩、染色质凝结、DNA片段化和凋亡体形成[9]。而高良姜素诱导肝癌细胞发生细胞凋亡的主要机制可能与内质网应激和线粒体依赖凋亡途径等因素有关。

2.1 内质网应激途径 内质网是一个游离钙离子(Ca2+)池，是蛋白质折叠和组装的特殊位点，各种生理和病理刺激，例如细胞缺氧、氧化应激反应、细胞DNA损伤、营养不良等均会激活未折叠蛋白质反应和内质网应激，从而促进细胞凋亡[10]。

内质网应激相关蛋白在诱导凋亡中起关键作用，包括C/EBP同源蛋白质(C/EBP homologous protein，CHOP)和葡萄糖调节蛋白(glucose-regulating protein，GRP)家族中的GRP78、GRP94，后者是位于内质网的分子伴侣，促进错误折叠的蛋白质降解。高良姜素可抑制肝癌细胞中的钙通道，使得细胞质内的游离Ca2+浓度增高，进而引起内质网应激相关蛋白CHOP、GRP78、GRP94水平升高，而这三种蛋白的升高又使胞质游离Ca2+浓度进一步增加。高良姜素还促使丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，亦会提升胞质内游离的Ca2+浓度，这些机制最终促成了内质网应激反应，使得如HepG2/G3等肝癌细胞发生凋亡[11]。

2.2 线粒体依赖途径 线粒体作为细胞的能量工厂，其氧化磷酸化的顺利进行取决于线粒体膜电位水平是否正常。Bcl-2蛋白家族控制线粒体外膜透化，分为促凋亡蛋白(Bax、Bad和Bid等)或抗凋亡蛋白(包括Bcl-2本身和Bcl-XL等)，前者可通过线粒体依赖途径引起线粒体通透性增加，诱导凋亡；后者则可以阻止这些线粒体事件的发生。细胞色素C由Bax基因调控，与凋亡蛋白酶激活因子1结合后，构象发生改变，形成凋亡复合体，随后招募胞质中的procaspase-9发生自切割活化，成为caspase-9，再激活caspase-3。最终多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶被caspase-3裂解，导致细胞发生凋亡[12]。高良姜素是一种强亲脂性化合物，可直接进入肝癌细胞，降低线粒体膜电位，增加膜通透性，促使细胞色素c从线粒体向细胞质释放，导致促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白在线粒体膜上发生移位，增加促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体是一种潜在的具有抗肿瘤效应的蛋白质，最近被认为是肝癌的潜在治疗靶点，其原因在于该配体对细胞凋亡信号的转导具有重要的影响[13]。死亡诱导信号复合体亦参与细胞凋亡信号转导，它是由Fas分子的胞内段死亡结构域结合Fas相关的死亡域蛋白(Fas associated death domain protein，FADD)，再与procaspase-8结合构成，即由Fas/FADD/procaspase-8组成的复合体。Zhang等[14]发现，高良姜素可通过与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体结合，并和死亡诱导信号复合体相互作用，激活凋亡相关蛋白caspase-8，切割Bid形成具有活性的截短Bid，后者转移进入线粒体，导致细胞色素c的释放，最终诱导肝癌细胞凋亡。

磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN)是一类磷酸酶活性物质，具有一定的肿瘤抑制作用，在肝癌细胞中可能是失活的，也可能是突变的[15]。现有研究[16]已经证实，高良姜素可以激活PTEN并使之表达上调，从而抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，降低细胞内AKT的磷酸化水平，最终诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。

3 诱导肝癌细胞自噬

细胞自噬可理解为细胞自我吞噬，是指在溶酶体作用下发生细胞自我降解的过程，也是受损、功能障碍或多余细胞器和蛋白质被隔离、吞噬并回收，以维持细胞代谢、生存能力和稳态的过程[17]。

TGFβ/JNK或TGFβ/Smad通路在细胞生长、分化和迁移中起重要作用。Wang等[18]发现，高良姜素可以增加TGFβ受体(包括受体R1和受体R2)的水平，从而使JNK磷酸化或受体调节型Smads(包括Smad1～4)的水平进一步升高，但导致抑制型Smads(包括Smad6、7)的水平降低，随后参与细胞自噬的Beclin1蛋白水平增加。Beclin1又称细胞自噬相关基因6(autophagy-related gene 6，ATG6)。 Beclin1、ATG16、ATG12与高良姜素诱导的Bcl-XL水平升高和Bcl-2水平降低相互作用，然后和ATG5相结合，促进自噬泡形成，诱导细胞自噬。

高良姜素通过增加单磷酸腺苷占总腺苷核苷酸的比例，进一步增加单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)磷酸化，抑制AKT和mTOR的磷酸化，从而促进HepG2细胞产生细胞自噬[19]。

微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3，LC3)又称为ATG8，它结合磷脂酰乙醇胺脂质化并插入自噬泡膜中，促使自噬泡形成并与溶酶体融合，而该过程离不开沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)的调控，SIRT1是一种组蛋白去乙酰化酶[20]，其对LC3的脱乙酰化作用是LC3脂质化并参与自噬泡形成的前提。高良姜素通过AMPK/SIRT1信号通路或ATG5、ATG7和ATG8去乙酰化上调SIRT1的表达，增强了SIRT1对LC3的脱乙酰化作用，从而诱导HepG2细胞自噬[21]。

p53基因是一种重要的抑癌基因。有文献[22]称，在HepG2和Hep3B这两类细胞中，低浓度的高良姜素(130 μmol/L)上调p53的表达诱导自噬。

4 抑制肝癌细胞转移

肝癌细胞转移的过程包括基质金属蛋白酶(主要是MMP2和MMP9)、细胞外基质降解蛋白对细胞外基质的局部降解，肿瘤组织浸润基质和进入血管，最后迁移、外渗及侵袭[23]。

高良姜素对咐醇酯诱导的HepG2细胞黏附、浸润和迁移具有抑制作用。高良姜素能够对咐醇酯所诱导产生的蛋白激酶C起到显著的抑制作用，诱导细胞外信号调节激酶1/2产生相应的磷酸化抑制效应，进而抑制核因子-κB和激活蛋白-1与MMP2/MMP9启动子的结合能力，从而抑制其转录过程，降低MMP2和MMP9的活性与表达，最终抑制肝癌细胞的转移[24]。

5 展望

恶性肿瘤及其癌旁组织局部新生成的血管有助于向肿瘤组织输送氧气和营养物质，因此，抑制恶性肿瘤局部新生血管形成成为恶性肿瘤临床治疗的热点，同时也是难点。根据以往的文献报道，肿瘤组织的血管生成与细胞外因子相关，其中报道最多的为血管内皮生长因子，其作用机制包括促进内皮细胞生成与增殖、迁移与形成血管的作用，同时它还有助于内皮细胞的局部浸润，通过以上作用机制促进肿瘤局部的新生血管形成[25]。高良姜素的抗血管生成作用已经在卵巢癌细胞中得到证实[26]，尽管血管内皮生长因子在肝癌细胞内亦存在高表达[27]，但目前高良姜素是否对肝癌细胞具有抗血管生成作用尚不明确，期待更多此方面的研究成果。

癌细胞在一定程度上具有耐药性，能够耐受多种药物，被研究者称为多药耐药(multidrug resistance，MDR)。MDR会导致癌症的化疗及其他治疗方法疗效减弱。在人类癌细胞中存在着多种多药耐药蛋白，最主要的有3种，分别是乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)以及多药耐药蛋白1。最新研究[28]表明，一些植物、食品和草药中含量丰富的黄酮类化合物例如高良姜素有助于逆转MDR，其机制可能是高良姜素可作为一种多功能的调节剂，对导致MDR的关键因素发挥负性调节作用。2019年，Zhu等[29]研究发现该类化合物的衍生物三唑桥联类黄酮二聚体能够对乳腺癌抑制蛋白-ATP酶的活性产生一定的抑制作用，通过阻断BCRP的药物外排活性、提高细胞内药物蓄积的作用，最终恢复BCRP过表达细胞的药物敏感性。因此，现有的证据表明，高良姜素及其衍生物在逆转临床MDR方面具有潜在的临床应用前景，期待更多的研究聚焦于此。

高良姜素联合黄连素可通过增加活性氧诱导细胞凋亡、抑制细胞周期，从而抑制食管癌细胞的生长和增殖，且在体内外均无明显毒性[30]。此外，低浓度的高良姜素联合顺铂可诱导肺癌细胞凋亡，即使在对顺铂具有耐药性的细胞中亦是如此[31]。这说明高良姜素与其他抗癌药物联合用于逆转MDR可能更为有效。然而，迄今为止尚未有高良姜素与其他药物联合作用于肝癌细胞的报道，期待此方面更多的研究。

高良姜素的临床应用仍有一定的局限性，其中最为突出的问题是难以溶于水，使得高良姜素在人体内代谢速度快，难以被人体吸收，从而限制了其在临床应用推广。为克服此问题，Patil等[32]制备了肝靶向高良姜素半乳糖基化Pluronic F68聚合物胶束，从而降低了其在体内的代谢速度，提高了肝内高良姜素的浓度，从而延长了高良姜素在肝内的消除时间，该研究促进了高良姜素临床治疗应用的转化，并使之成为可能。

6 小结

高良姜素是一种新的抗癌候选药物，其抑制肝癌细胞的作用机理主要在于逆转肝癌细胞的Warburg效应，并让其细胞周期停滞于G0/G1期，发挥抗增殖作用；通过内质网应激和线粒体依赖性凋亡途径诱导细胞凋亡；诱导自噬、抑制肝癌细胞转移。目前高良姜素在抑制肝癌血管生成、克服MDR以及与其他药物联用方面的研究较少。此外，其在体内代谢迅速，生物利用度低，因此，高良姜素的修饰、相关衍生物的合成、制备纳米载药系统是非常重要的降低代谢速度、提高生物利用度的方法。再者，目前有关高良姜素对肝癌细胞作用的研究多集中于细胞及动物模型水平，需在临床试验中对其疗程、副作用和预后做全面研究，以便考虑是否可以将高良姜素作为临床抗肝癌药物。

作者贡献声明：李程负责分析资料，拟定思路，撰写论文；张惠文负责收集资料，参与修改论文；容鹏飞负责指导撰写文章并最后定稿。