不同产地的大枣药材UPLC指纹图谱及含量测定方法研究

曾杉，甘伟发，史紫娟

(国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303)

大枣(ZiziphusjujubaMill.)俗名又称红枣，是鼠李科植物枣的成熟果实，临床上具有补中益气、养血安神的效果，具有很高的食用和药用价值。大枣在中药复方中入药的历史十分悠久，在《伤寒论》、《本草纲目》、《千金翼方》等多部古籍中均有入药记载。现代药理学研究表明，大枣在抗肿瘤、改善心脑血管系统、增强人体免疫力和造血功能等方面均有明显药效[1-2]。大枣化学成分复杂，含有多达上百种成分，主要成分为核苷酸类、生物碱类、皂苷类、黄酮类、糖类化合物等，其中包括环磷腺苷(cAMP)、尿嘧啶、鸟苷、芦丁、槲皮素、葡萄糖和鼠李糖等多种化学成分[3]。

中药配方颗粒是饮片采用传统水煎煮方式提取后通过现代成型工艺制备所得的颗粒制剂，具有服用、贮藏方便且易于携带等诸多优点。中药配方颗粒质量标准的提高需深入开展药材饮片特征图谱研究，并建立原料质量控制体系[4]。环磷腺苷(cAMP)是大枣的主要水溶性成分之一，果实中含量最高，在生理生化过程中作为反向调节的第二信使，在基因转录和蛋白质合成中发挥重要作用。美国药典委员会出版的《草药法典》(Herbal Medicines Compendium)标准集中收载了大枣的相关质量标准，该标准以环磷腺苷为含量测定指标并规定其质量分数不得少于0.010%。目前，对于大枣药材指纹图谱和含量研究文献相对甚少[5-7]，2015年版《中国药典》制定的大枣药材标准中仅通过性状、显微、薄层鉴别等项目控制大枣药材的质量，并无含量测定和指纹图谱项[8]。本研究建立了15批不同产地大枣药材的指纹图谱和含量测定的UPLC法，完善和提高了大枣药材的质量控制标准，为提高大枣配方颗粒的质量控制水平提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

H-class UPLC高效液相色谱仪(PDA二极管阵列检测器，Water公司)；AL104 型电子天平(Mettler Toledo公司)；KQ-500DE型超声仪(昆山超声仪器有限公司)；M Millipore Synergy UV 超纯水仪(美国默克公司)。

1.2 试药

对照品：环磷腺苷(中国食品药品检定研究院，批号：140709-201404)，芦丁(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201610)，5-羟甲基糠醛(中国食品药品检定研究院，批号：111977-201501)，鸟苷(中国食品药品检定研究院，批号：111977-201501)；甲醇、乙腈为HPLC级，实验用其他试剂均为AR级。

1.3 样品

15批大枣药材(编号S1-S15)分别从河南、山东、山西、甘肃、河北等不同产地购得，其中编号S1-S3采集地点为山东省临沂市平邑县，编号S4-S6采集地点为河南省安阳市内黄县，编号S7-S9采集地点为甘肃省武威市民勤县，编号S10-S12采集地点为山西省长治市沁源县，编号S13-S15采集地点为河北省沧州市沧县，按2015年版《中国药典》检验均合格。

2 指纹图谱方法的建立

2.1 色谱方法

色谱柱：Waters HSS T3(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流动相：0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～3 min，0%B；3～12 min，0%→10% B；12～25 min，10%→20%B；25～30 min，20%→95%B)；柱温：30 ℃；流速：0.25 mL/min；波长：254 nm；进样量：1 μL；理论塔板数按环磷腺苷峰计应不低于10 000。

2.2 对照品溶液的制备

取环磷腺苷、5-羟甲基糠醛、鸟苷、芦丁对照品适量，精密称定，加40%(体积分数，下同)甲醇制成每1 mL分别含环磷腺苷50 μg、5-羟甲基糠醛20 μg、鸟苷50 μg、芦丁20 μg的对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取大枣药材粉末(过三号筛)约2.0 g，精密称定，置具塞量瓶中，精密加入40%甲醇20 mL，称定质量，超声处理(500 W，40 kHz)20 min，取出，放冷，用40%甲醇补足损失质量，5 000 r/min离心5 min，取上清液，滤过，即得。

2.4 共有峰的确认

精密吸取“2.2”项下的对照品溶液和“2.3”项下供试品溶液各1 μL，进样测定，记录色谱图，结果显示峰6、峰7、峰9和峰14保留时间分别与鸟苷、环磷腺苷、5-羟甲基糠醛和芦丁对照品保留时间相对应，见图1。

图1 对照品及大枣药材的HPLC色谱图Figure 1 HPLC of reference substances and Ziziphus jujube

2.5 指纹图谱方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一批药材(编号：S4)按“2.3”项方法制备溶液，连续进样6次，以环磷腺苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积RSD值均小于5.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取同一份供试品(编号：S4)溶液，按“2.1”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、16、24 h进样测定，以环磷腺苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积RSD值均小于5.0%，表明供试品溶液24 h内稳定性较好。

2.5.3 重复性试验 取同一批药材(编号：S4)，按“2.3”项方法平行制备6份供试品溶液进样测定，以环磷腺苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积RSD值均小于5.0%，表明方法重复性良好。

2.5.4 中间精密度试验 取同一批药材(编号：S4)，由不同实验人员在不同日期按“2.3”项方法平行制备6份样品进样测定，以环磷腺苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积RSD值均小于5.0%，表明方法中间精密度良好。

2.6 指纹图谱的测定

取15批不同产地的大枣药材按“2.3”项方法制备供试品溶液进行测定，将结果导入相似度软件进行拟合并生成对照指纹图谱，选择峰面积稳定的色谱峰作为共有峰，最终确定14个稳定的共有峰，并通过对照品指认其中的鸟苷、环磷腺苷、5-羟甲基糠醛和芦丁4个已知峰，相似度计算结果显示15批大枣药材样品的指纹图谱相似度均高于0.90以上，表明不同产地的大枣药材成分差异不大，质量稳定，结果见图2、图3和表1。

图2 15批大枣药材HPLC指纹图谱叠加图Figure 2 HPLC fingerprint of 15 batches of Ziziphus jujube

峰6.鸟苷； 峰7.环磷腺苷； 峰9. 5-羟甲基糠醛； 峰14.芦丁。

表1 15批大枣药材相似度分析结果Table 1 Results of similarities test of 15 batches of Ziziphus jujube

3 大枣药材中环磷腺苷质量分数的测定

3.1 对照品溶液的制备

取环磷腺苷对照品适量，精密称定，加40%甲醇制成每1 mL含环磷腺苷10 μg的溶液，即得。

3.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过三号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞量瓶中，精密加入40%甲醇溶液10 mL，称定质量，超声处理(500 W，40 kHz)30 min，放冷后用40%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，即得。

3.3 色谱条件

色谱柱为Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以甲醇-0.05 mol/L KH2PO4溶液溶液(体积比8∶92)为流动相；检测波长为259 nm；进样量为1 μL；流速为0.4 mL/min；柱温为30 ℃。按上述色谱条件取对照品、空白溶剂和供试品溶液进行，色谱图见图4。

图4 环磷腺苷对照品、空白溶剂及大枣药材的色谱图Figure 4 HPLC of cAMP, blank control and Ziziphus jujube

3.4 方法学考察

3.4.1 线性关系考察 精密称取环磷腺苷对照品10.73 mg，置50 mL量瓶中，加40%甲醇定容，作为储备液。分别精密量取上述储备液稀释成1.073、5.365、10.73、21.46、42.92 μg/mL的对照溶液，精密吸取各浓度对照品溶液1 μL，注入液相色谱仪，按“3.3”项色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标、环磷腺苷的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程Y= 0.7 046X- 0.040 7，r=1.000 0，表明环磷腺苷质量浓度在1.073～42.92 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

3.4.2 精密度试验 取大枣药材(编号：S8)按“3.2”项方法制备供试品溶液，连续进样6 次，计算环磷腺苷峰面积RSD值为0.09%，表明仪器精密度良好。

3.4.3 稳定性试验 取新制备的供试品溶液(编号：S8)分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h进样测定，计算环磷腺苷色谱峰峰面积RSD值为0.26%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.4.4 重复性试验 取同一批大枣药材(编号：S8)同法平行制备6份溶液进样，计算环磷腺苷平均质量分数为221 μg/g，其RSD值为0.49%，表明方法重复性良好。

3.4.5 加样回收率试验 精密称取折干后量分数为221 μg/g的大枣药材粉末(编号：S8，水分：18.5%)约0.5 g，平行6份，各加入环磷腺苷对照品97.80 μg，按“3.2”项方法制备供试品溶液，进样测定，分别计算加样回收率，结果见表2。可见，腺苷加样平均回收率为104.10%，RSD值为3.81%，表明方法准确度良好。

表2 环磷腺苷加样回收率试验结果Table 2 Results of recovery of cAMP

3.5 15批大枣药材中环磷腺苷质量分数的测定 取15批不同产地大枣药材样品，按“3.2”项方法制备供试品溶液，按“3.3”项色谱条件测定环磷腺苷的质量分数，结果见表3。可见，15批不同产地的大枣的环磷腺苷质量分数在101～441 μg/g之间，不同产地间的差异不大，以山西省、河南省、甘肃省的较高，山东省和河北省的较低。

表3 15批大枣药材中环磷腺苷质量分数的测定结果Table 3 Determination results of cAMP in 15 batches of Ziziphus jujube

4 讨论

在指纹图谱方法的建立中，分别进行PDA检测器全波长扫描比较了不同波长下的差异，考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸和甲醇-0.1%磷酸不同流动相体系，并比较了25、30、35 ℃柱温的差异，最终选择30 ℃柱温下、乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱、波长254 nm的色谱条件。

由于环磷腺苷为水溶性成分，本研究在质量分数测定方法的建立时考察了水、40%甲醇、70%甲醇和稀乙醇4种溶剂对环磷腺苷的提取效果，结果显示40%甲醇提取效率最高；同时比较了超声提取和回流提取2种提取方式对提取效率的影响，结果显示超声处理30 min的提取效果更好，操作简单。指纹图谱指认了鸟苷、环磷腺苷、5-羟甲基糠醛和芦丁4个成分，由于环磷腺苷质量分数最高，达到万分之一以上，其余3个成分质量分数均低于万分之一，误差较大，因此本研究以环磷腺苷作为质量分数测定指标，其他3个成分不作测定要求。

本研究测定了15批不同产地的大枣药材UPLC指纹图谱，共确定了14个特征峰，指认了鸟苷、环磷腺苷、5-羟甲基糠醛和芦丁4个已知峰，相似度计算结果显示15批大枣药材的指纹图谱相似度均高于0.90以上。同时建立了大枣药材中环磷腺苷质量分数测定方法，结果显示15批不同产地的大枣的环磷腺苷质量分数在101～441 μg/g之间，不同产地间的差异不大，以山西省、河南省、甘肃省的较高，山东省和河北省的较低，与文献[6]中山东大枣药材含量(168 μg/g)基本相符。

综上所述，本研究中建立大枣药材指纹图谱和质量分数测定的方法简单易操作，稳定性和重复性均良好，可作为大枣药材的质量控制方法。