基于基质辅助激光解吸电离质谱成像技术对高血脂模型大鼠脑部脂质变化的研究

梅颖，胡辉，郐一贺，谭文

(广东工业大学生物医药研究院，广东 广州 510006)

质谱成像是指将质谱检测与病理图像相结合，应用于解析样品表面多种分子化学组成及各组分的空间立体结构信息的一种新型分子影像技术，该技术具有较高的灵敏度和较宽的质量检测范围，尤其在检测组织中脂类等小分子的优势明显。

基质辅助激光解吸电离质谱(MADLI-MSI)最先由美国科学家 Caprioli等[1]提出。通过选择合适的基质将 MADLI-MSI 喷洒在组织切片的表面上，并通过激光照射使样品与基质形成共晶，基质从激光吸收能量而将其传递给生物分子[2]。生物分子随后被电离，离子在电场的作用下陆续飞过飞行管，并根据到达探测器的飞行时间进行各个离子的检测。同时待测离子的质荷比与离子的飞行时间成比例。质谱软件根据切片的大小将图像划分为由若干点组成的二维晶格，并且计算机虚拟扫描质谱数据以形成组织的二维离子密度图像。将每个点处的质谱数据进行归一化处理以获得表示该区域中化合物分布的质谱图。最后由所有数据集可获得组织切片的化学成分和空间分布信息[3]。化合物的相对丰度由峰高或峰面积表示，相对丰度由亮度强度或不同颜色图案表示。此技术经过不断的发展，目前可实现从蛋白质[4]、多肽[5]等生物大分子到脂类[6]等中分子量生物分子和小分子药物的分析[7]， 虽然在国外该技术已被广泛应用于生物科学研究的许多领域但在国内由于仪器设备的限制，用该技术研究并不常见。

脂质组学是对生物体中的细胞、组织和器官相互作用的脂质和分子的全面和系统的分析。多种研究表明脂质与各种疾病的发生发展密切相关，但由于脂质分子结构的多样性和复杂性，想要探究脂质的结构和功能，进一步了解脂质与人体病理学和生理学的关系显得相当困难。 近几年在脂质组学领域应用高分辨率质谱技术能够快速、高通量地分析各种生物脂质成分，进行大规模的整体脂质组学分析。

本研究运用MADLI-MSI质谱成像技术，对大鼠高血脂造模后的脑组织标本进行了分析，目的寻找能够阐述病变过程的潜在生物分子以及高脂模型中的可能脂质改变，并进一步通过生物分子之间可能的内在相关性进行探讨，阐述并发现潜在标志物分子的生物学意义并为其他类似研究提供新的实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，SPF级，体质量100～120 g,周龄5～6周。购于南方医科大学动物实验中心，生产许可证号SCXK(粤)2016-0041。高脂高胆固醇饲料购于北京博宏达生物科技有限公司。

实验试剂：基质 DHB、9-AA购于美国Sigma公司；甲醇、乙醇、聚丙烯胺标准品购于Fisher公司；三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器和仪器参数

1.2.1 实验仪器 US 2016/0278400A1 image PreP喷洒(德国Bruker)；rapifle X MADLI-TOF/(德国Bruker)； Enspire酶标仪(铂金埃尔墨公司)。

1.2.2 仪器参数 MADLI-IMS 测定条件：(1)正离子模式：质谱采集范围为600～1 200；采集模式为反射模式；分辨率为50 μm； 激光光斑数为 300/pixel；激光聚焦设置为 M5 small；离子源 1 电压为 20 kV； 反射器 1 电压为 20.9 kV；反射器 2 电压为 1.085 kV；反射器 3 电压为 8.6 kV； 透镜电压为 11.6 kV。(2)负离子模式：质谱采集范围为600～1 200；采集模式为反射模式；分辨率为50 μm； 激光光斑数为 500/pixel；激光聚焦设置为 M5 small；离子源 1 电压为 20 kV； 反射器 1 电压为 20.9 kV；反射器 2 电压为 1.085 kV；反射器 3 电压为 8.6 kV； 透镜电压为 11.6 kV。

1.3 方法

1.3.1 大鼠高血脂模型的建立和取材 SD大鼠在进入动物实验室后适应性喂养1周， 在适应性喂养期间对其进行观察，若出现厌食、体质量明显下降情况，及时剔除问题大鼠，不进行建模试验。7 d适应性喂养结束后，随机挑取24只分为正常组12只，高脂模型组(HFD)12只。 模型组大鼠进行高脂饲料喂养5周，饲料的配方为：猪油 10% ，蛋黄粉5%，胆固醇 2%，三号胆盐0.5%，维持底料 82.5%。5周后禁食不禁水12 h采用眼静脉丛采血。分离血清测定血清中TG、TC等血脂含量，若血脂显著高于正常组大鼠说明高脂建模成功可以进行下一步试验。取成模后的大鼠继续喂养5周，其饲料配方为：猪油 10% ，蛋黄粉5%，三号胆盐0.5%，维持底料 82.5%。到第10周时，采血，分离血清测定TG、TC等血脂含量，采用摘眼球法在鼠的右侧眼球根部摘去眼球收取血液安乐死动物，用左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨，后用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头，直接就掀起取出脑组织冷冻、切片，进行质谱成像实验。

1.3.2 生化指标的检测 参照试剂盒说明书测定TG、 FFA、TC 水平。

1.3.3 脑组织切片的制作 将脑组织从冰箱取出后，移入切片机内，放置 20 min，然后在冷冻切片机中进行冰冻切片。将每例标本在手动模式下切出厚度为 10 μm 的切片用于 MADLI-MSI 成像，可将切片储存于超低温冰箱备用。

1.3.4 样本组织预处理 将冰冻的切片置于真空干燥器中，干燥大约 30 min，待切片表面无明显的水份即可用于下一步实验。在玻片上做好标记，用纸片将标记遮住，待成像时这些标记可用于坐标定位。将 30 mg/mL 的 DHB 溶液使用 Image Prep 喷洒仪将基质溶液喷洒到组织片上，以此作为采集正离子信号的样本；将 10 mg/mL的9-AA 溶液使用 Image Prep 喷洒到组织片上，作为采集负离子信号的样本。由于采集的主要是脂类分子的信号，而在此条件下，脂类分子的相对丰度较高，故脑组织可不用作其他的预处理。

1.3.5 质谱成像数据的采集 切片采用 MADLI-MSI 进行成像处理分析。MADLI-MSI 成像时，在正、负离子检测模式下采集质谱数据，采用全扫描模式，扫描范围设定在 600～1 200；数据采集分别釆用了数据处理系统及仪器控制及数据处理系统。在数据采集前，需要对切片进行喷基质处理，然后将切片送入质谱仪，随后用标准品进行校正，并调整激光能量，使所采集质谱峰的分辨率达到 10 000，质谱峰信号强度达到 104级别，待方法达到要求后可保存该方法用于组织成像数据的采集，然后在组织成像软件中设置要采集的切片位置和范围，最后开始采集样品表面组织的质谱信号。

1.3.6 质谱成像分析与数据处理 数据处理过程包括分割分析、多变量统计分析和 ROC 分析等几个过程。首先检测获得原始质谱数据，将数据文件(.mis 格式)转换成为数据分析格式(.sl 格式)，之后将格式的文件采用成像软件 SCiLS Lab 批量处理,进行上述的分割分析、多变量统计分析和 ROC 分析并输出。

1.3.7 统计学处理 采用GraphPad Prism 5统计学软件,组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 高血脂模型的评价

高血脂模型组与正常组比较， FFA、TC、TG 水平显著升高，差异均有统计学意义，表明大鼠高血脂模型建立成功。见表1。

表1 血清中TC、TG、 FFA的含量Table 1 Contents of TG,TC and FFA in serum c/(mmol·L-1)

2.2 高血脂模型脑组织切片 MADLI-MSI 成像数据分析

结果见图1。高血脂模型组的脑组织与正常组相比，未见明显的差别。利用 SCiLS lab 软件进行分割分析，选择整片脑作为感兴趣的分析区域，结果发现两者的结果不管是在正离子(Positive ion mode)或者负离子模式(Negative ion mode)下，正常组和高血脂模型组均未见到明显的特征差异。

图1 大鼠脑片正常组和高血脂组MADLI-MSI 成像分割分析结果Figure 1 Results of MADLI-MSI image segmentation analysis

2.3 脑切片主成份分析(PCA 分析)

从图2可以看出两者在分布行为上相似，通过 PCA 分析不能将两组分开，故没有差异分子使两组数据产生差异。

A.正常组脑组织切片平均质谱图； B.高血脂组脑组织切片平均质谱图。

3 讨论

本实验通过采用 MADLI-MSI 质谱成像技术对实验动物疾病模型的脑组织进行了质谱成像和数据分析，主要内容包括正负离子检测模式下获得高血脂模型脑组织切片中的脂类分子信息，通过成像软件选取各标本中的感兴趣区域，对各切片数据进行分析，并进行PCA分析研究。通过对脑组织切片进行分组对比，探究与疾病病理进程和药物干预相关的差异分子信息。

对高血脂大鼠模型的脑组织分析结果表明在给予高脂喂食后，脑部的脂类分布未见显著的改变，说明在高脂诱导大鼠10周时其外周血液里的高血脂水平并不会影响到脑部脂类的分布改变，而Kothari 等[8]研究表明，高脂喂养14周C57BL/6NHsd 小鼠，发现小鼠脑部受损出现认知功能障碍。另外，最近也有类似文献报道，高脂喂养小鼠19周后通过GC-MS分析脑部脂质的分布发现有明显的变化[9]。分析原因可能是目前本研究的工作只是对10周高血脂大鼠进行脑片扫描分析，诱导周期短没有达到脑部损伤程度。具体如何后续工作还有待进一步研究。

本文研究结果为临床脑部研究提供了一定的理论依据，同时本文采用前沿MADLI-MSI质谱成像技术方法也为其他类似研究提供借鉴意义。