首次实现对线粒体DNA的基因编辑

来自细菌体的毒素是这套编辑体系的王牌。

CRISPR-Cas9基因编辑对生命科学领域的贡献有目共睹，不过还在蓬勃发展中的它依然有不少难点尚未攻克，“线粒体DNA（mtDNA）编辑”就是其中一个重大难点。

很多科研人员试图打破此局面。最近有捷报传来：有人跳出了CRISPR-Cas9的传统框架，借助一种独特的细菌酶实现线粒体中DNA的编辑，2020年7月8日研究成果刊载在《自然》（Nature）杂志上。

当然，很多人会有两个疑问：其一，我们为什么非要去编辑线粒体里那些少得可怜的DNA？其二，为什么线粒体基因要比细胞核里的基因难编辑得多？

何为碱基编辑

针对第一个问题，需要指出，mtDNA量虽少，但突变起来仍极具杀伤力。mtDNA在发生突变后，很可能引发某些母系遗传的特定疾病，往往会对神经系统和肌肉造成损伤（线粒体也容易因此丧失制造ATP的能力）。

第二个问题里的难点在于线粒体的保护屏障。目前人类可以借助CRISPR-Cas9对几乎每一个实验生物体的基因组进行调整——但这类操作要成功，有个重要环节不能少：研究者需要用一串特定的RNA链将Cas9酶引导至他们希望编辑的那个DNA区域。

Cas9酶很重要，负责目标区域的DNA双链解旋，令其成为可编辑的两条单链（局部而非整体解旋）。在操作细胞核DNA时，这一切都没问题；但当面对线粒体时，包覆在外的双层膜会把Cas9酶挡在外面。所以问题的核心就是重要人员进不去线粒体。

目前有一些科学家希望基于一种超高精准度的基因编辑系统——人称碱基编辑，解决线粒体基因编辑难题。

在详述如何让编辑工具进入线粒体内部之前，我们先介绍一下这个碱基编辑技术。顾名思义，操作者要对基因组里的单个碱基进行更改，如把胞嘧啶变成胸腺嘧啶。相比于一段一段地更改基因序列的常规基因编辑，精准操控每一个碱基的碱基编辑看起来已经把CRISPR的概念推到了极致。

2018年底，哈佛大学华裔科学家刘如谦收到一封电子邮件。信中来自华盛顿大学的微生物学家约瑟夫·穆格（Joseph Mougous）和同事在西雅图做实验时，发现一种由洋葱伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）产生的毒素具有催化作用，可以将胞嘧啶（简称C）转化为尿嘧啶（简称U）。

在DNA中不常见的U有着与胸腺嘧啶（简称T）相似的行为，所以如果转化得到了U，在某种程度上就可以当作是得到了T。简单一句话：来自洋葱伯克氏菌的毒素可以有效地将基因组序列中的C转化为T。

顺着与穆格差不多的思路，刘如谦等人借助类似的酶实现了碱基编辑。该酶是胞苷脱氨酶的一种，而胞苷脱氨酶也是一种细菌毒素。

弃Cas9，用DddA

以上这些都只是在理论上建构出了碱基编辑的体系，但要在现实中完成线粒体内的碱基编辑就很难了。穆格和刘如谦的酶都存在缺陷：通常只能对解开了螺旋的DNA单链进行碱基更改。这自然引出了前文提到的Cas9酶难题：要想解旋DNA，就得带上Cas9酶；可带上了Cas9酶，就进不去线粒体。所以他们需要另觅他法。

不久后，穆格这边有了好消息。他们发现了一种名为DddA的酶（胞苷脱氨酶的一种，双链结构）可以直接作用于双链DNA，无须依靠Cas9酶解旋。DddA开展工作时，能让双链DNA始终完好如初，润物细无声地完成“篡改”。

刘如谦和穆格一致认为，舍去Cas9酶，让DddA单枪匹马地杀向线粒体，就可以避开其外部膜的阻挡直捣基因组。最后的结果也确实如他们所愿。

不过在实际调用DddA的过程中，也存在不少难点。其中最主要的问题在于胞苷脱氨酶的本质是毒素，对哺乳动物的细胞有毒：DddA会把目力所及的全部胞嘧啶（C）都变成胸腺嘧啶（T），脆弱的生命体经不起这么狂躁的大换血。

要让DddA为基因编辑所用，就要先“驯服”它。研究团队将它分解成了两部分（名为split-DddAtox）：彼此分离时，则均处于无活性状态，对碱基不构成威胁；合体后，DddA就可以大展拳脚。另外，他们给两个split-DddAtox都连上了TALE蛋白，进而成为TALE-split-DddAtox。

在一起进入线粒体之后，TALE蛋白会连接上目标DNA片段，接着两个split-DddAtox也可以顺势合体，然后把C们转化成T们。

另一个关键环节是带路的向导。TALE-split-DddAtox需要有人领着它穿过内外两层的线粒体膜，然后找到mtDNA。刘如谦等人给TALE-split-DddAtox标记了一段氨基酸序列，作为线粒体靶向信号，帮助前者顺利抵达最终目的地。

换言之，他们用氨基酸序列代替以往的RNA，充当向导一角。实际上，有研究者认为，常规的CRISPR-Cas9 之所以没法搞定线粒体的DNA，除了Cas9会被挡在外面，RNA向导不受线粒体欢迎可能也是原因之一。

还有一个问题来自于这个假T碱基。前面我们说过，酶实际上是把C变成了U；又因为U具有与T相同的碱基配对特性，所以我们才把它当成T来看待。本质属于RNA的U在成为DNA链的一分子之后，会遭遇麻烦：尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil-DNA glycosylase）总想把U干掉，再换上C。

鉴于此，研究团队给TALE-split-DddAtox又加了一层保险：尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）。不仅保护U免受干扰，还将胞嘧啶的碱基编辑效率提高了8倍。

有望矫正49%的有害mtDNA突变

综上，我们得到了一套超凡的线粒体基因编辑装备，研究团队称其为DdCBE。它是这样工作的：TALE-split-DddAtox跟着一段氨基酸序列，通过线粒体的双层膜，抵达mtDNA处。接着，TALE蛋白锁定并连接mtDNA上的目标区段。与此同时，两个split-DddAtox合二为一成为DddA，开始启动更改碱基的程序。

DdCBE及其正要进入的线粒体区域的示意图

脱靶效应，即非预期位点的DNA修饰，是CRISPRCas9基因编辑的一个常见问题。在分析比对了编辑后的细胞与对照组细胞后，他们发现前者的细胞核中并未出现预期以外的DNA修饰。

研究团队在论文里报告指出，这一套编辑体系有望矫正49%的已知有害mtDNA突变。

当然，刘如谦认为这项工作距离临床应用还差很远。尽管他们现阶段的脱靶情况不明显，但更多针对不同细胞类型的尝试必不可少。

资料来源 Nature