甘草次酸对四氯化碳小鼠胫骨骨微结构的影响

陈继铭 吴晓静 刘田丰 陈海聪 黄成硕

(广东医科大学附属医院骨科中心，广东湛江， 524023)

草次酸是甘草中天然产物甘草酸的三萜苷元成分[1,2]。甘草次酸的药理作用有：抗炎[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗病毒[6]、保肝[7]和促进胰岛素吸收[8]等。甘草次酸在抗炎护肝作用中均显示出较好活性[9-11]。甘草次酸有显著的抗氧化作用，可抑制四氯化碳生成游离基及过氧化脂质[12-14]。甘草次酸可通过增强Nrf2核转录及下游目的基因调控，缓解四氯化碳皮下注射诱导小鼠肝纤维化的作用，从而影响体内氧化和抗氧化系统的平衡[15]。另外，四氯化碳对小鼠致肝损伤的动物模型可造成骨质疏松，其原因可能与肝受损不能合成某些蛋白或是细胞因子有关[16]。本实验建立四氯化碳致小鼠肝损伤的动物模型，观察甘草次酸在护肝的同时，是否具有预防四氯化碳致小鼠肝损伤后出现的骨丢失作用，为其应用于临床防治肝性骨病提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

24只普通级昆明种10周龄的小白鼠，体质量(32.42±4.27)g，雌雄各半。购买于南方医科大学实验动物中心，动物质量合格证为：SCXK(粤)2013-0002。

1.1.2 实验药物、实验仪器与试剂

药物：甘草次酸(西安富捷药业有限公司，20160930)；四氯化碳(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)，用食用花生调和油配制成40%(体积分数)的四氯化碳油溶液。

实验仪器：赛多利斯BT 25S电子天平(德国Sartorius)；Micro CT仪(SCANCO Medical AG，型号viva CT40)；Eppendorf 5415R小型高速冷冻离心机(德国Eppendorf)。

试剂：谷丙转氨酶测定试剂盒(ALT)和丙二醛测试盒(MDA)，均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

小鼠按体重随机分成3组，每组8只。具体为(1)对照组(CON)：皮下注射0.1mL/10g花生油，每5d注射一次，首剂加倍，灌胃10ml/kg/d蒸馏水；(2)模型组(MOD)：皮下注射0.1mL/10g的40%(体积分数)四氯化碳花生油溶液，每5d注射1次，首剂加倍，灌胃10ml/kg/d蒸馏水；(3)甘草次酸(GA)：按模型组同法造模，灌胃50mg/kg/d甘草次酸。动物饲养环境相同，自由饮水及进食，每隔一周称1次体重。实验连续四周，于结束前一天禁食12h，后摘眼球取血，分离血清测定ALT；取肝脏称重并制备肝匀浆测MDA；取右侧胫骨进行Micro CT扫描。

1.3 主要观察指标

1.3.1 小鼠肝脏系数的计算[16]

肝脏系数=肝脏重量(g)/小鼠体重(g)×100%。

1.3.2 血清ALT活性的检测

小鼠血样3000r/min离心10min，取血清，按试剂盒说明测定。

1.3.3 肝匀浆MDA活性的检测

称取肝脏相同部位0.2g，用1.8mL冷生理盐水制10%肝匀浆，按试剂盒说明测定。

1.3.4 胫骨Micro CT检测

小鼠胫骨Micro CT扫描[16]：电流114μA，电压70kVp，扫描时间为24.8min，间隔时间为200ms，分辨率为中度。进行角度为180?倖的投射，对同一样品扫描获得500张不同截面的1024×1024像素的图片，对于胫骨选取距生长板远端1mm，层厚2mm的骨组织为兴趣区域进行三维重建。经分析得到参数[17]：骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁分离度(Tb.Sp)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨组织矿物密度(BMD)、连接密度(Con.D)、结构模型指数(SMI)以及各向异性的程度(DA)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠体重的变化

如表1所示，实验结束时，CON组小鼠实验后体重增加8.54%，MOD组小鼠实验后体重增加0.36%，GA组小鼠实验后体重增加6.91%。

表1 小鼠体重的变化

2.2 小鼠肝脏指数的变化

如表2所示，与CON组比较，MOD组小鼠肝脏指数增加了31.78%(P<0.05)。与MOD组相比，GA组的肝脏指数明显下降15.43%(P<0.01)。

表2 小鼠肝脏指数的变化

2.3 小鼠血清ALT活性和肝匀浆MDA的变化

如表3所示，与CON组比较，MOD组小鼠ALT和MDA活性均明显升高，分别升高了209.91%(P<0.01)、83.65%(P<0.05)。与MOD组相比，GA组的ALT和MDA活性均明显降低，分别降低了79.41%(P<0.05)、46.58%(P<0.05)。

表3 小鼠肝匀浆MDA的变化

2.4 小鼠胫骨骨微结构参数的变化

如表4和5所示，与CON组比较，MOD组小鼠BV/TV、Tb.N、DA、Conn.D、BMD明显降低，分别降低了46.15%(P<0.01)、56.52%(P<0.01)、23.61%(P<0.01)、72.23%(P<0.01)、56.62%(P<0.05)；Tb.Sp、SMI明显增加，分别增加了216.67%(P<0.05)、49.28%(P<0.01)。与MOD组相比，GA组小鼠BMD明显增加，增加了102.58%(P<0.01)。

表4 小鼠胫骨骨微结构参数的变化

表5 各组小鼠Micro CT参数的变化

2.5 小鼠胫骨Micro CT三维图的变化

与CON组比较，MOD组小鼠骨小梁数目减少、断裂、变短，中央区域出现很大的空腔。与MOD组相比，GA组小鼠骨小梁数目增多，骨小梁链接较为紧密，而且出现的网状结构较为明显，骨微观结构保持完整。见图1。

(注：CON为对照组，MOD为模型组，GA为甘草次酸组。SEG图反映骨小梁的数量)图1 小鼠胫骨Micro CT三维SEG图

3 讨论

四氯化碳经细胞色素P450代谢可引起细胞膜发生脂质过氧化反应，破坏细胞膜，致使肝细胞变性坏死[18]。因肝细胞受损导致血清中ALT和AST的活性显著升高；而MDA含量可反映肝损伤的严重程度[19]。本实验中，与CON组比较，MOD组小鼠肝脏指数、ALT和MDA活性明显增加，说明四氯化碳可造成小鼠肝损伤。与MOD组相比，GA组小鼠肝脏指数、ALT和MDA活性明显下降，提示四氯化碳可致肝损伤，血液中ALT含量增加，引发体内MDA含量的提高，经甘草次酸给药，对肝脏有一定程度的保护作用，血液中ALT与肝脏中MDA含量减少。甘草次酸可能减少MDA含量，可增强内源性氧自由基清除系统的功能，防止或减轻肝脏的损伤，从而发挥保护作用[9]。

Micro CT扫描可较大程度克服骨组织形态计量学测量方面存在的问题，成为研究骨微观结构的新技术，是研究骨形态学的理想工具[20]。本实验中，与CON组比较，MOD组小鼠胫骨BV/TV、Tb.N、DA、Conn.D、BMD明显降低，Tb.Sp、SMI明显增加；三维图显示骨小梁数目减少变短、断裂，中央区域出现很大的空腔，说明腹腔注射四氯化碳可造成小鼠出现骨量丢失严重，且骨微结构严重被破坏。可能是肝受损后不能合成影响体内激素、细胞因子和有毒物质的相关蛋白或是细胞因子，从而影响骨代谢[16]。而与MOD组相比，GA组小鼠胫骨BMD明显增加，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D数值上均有增加；Tb.Sp、DA、SMI数值上均有减少，但差异均无统计学意义；三维图显示骨小梁数目增加，骨小梁紧密连接，网状结构较较明显，保持较完整的骨微观结构。甘草次酸有很强清除-OH及O2-自由基的作用，可能通过氧化应激途径缓解四氯化碳致小鼠骨丢失[21]，另外甘草次酸具有雌激素样作用，且其雌激素样作用可能是ER介导产生的[22]，具体机制有待下一步研究。