黄连解毒汤联合头孢他啶治疗小鼠铜绿假单胞菌肺炎

车路阳，赵晓东，陈丽萍，李晶哲

（1.中国人民解放军总医院第四医学中心急救部，北京 100037；2.中国中医科学院 医学实验中心免疫学实验室，北京 100007）

铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa，PA），旧称绿脓杆菌，是院内感染的最常见条件致病菌，在长期使用抗生素的高龄患者及其他免疫力低下患者中具有较高感染率[1-3]。目前，铜绿假单胞菌表现出较强的耐药性，且耐药谱呈现逐年递增趋势[4-7]，PA引起的下呼吸道感染特别是铜绿假单胞菌肺炎（PAP）迁延难愈，病死率高[5,8]，加之易产生耐药菌株，治疗难度大，是临床高度关注和亟待解决的急症。

目前下呼吸道铜绿假单胞菌感染常使用化学合成抗生素进行联合治疗[9-10]，但铜绿假单胞菌广泛耐药性，加之长期应用抗生素引起的菌群失调和肝肾损害等不良反应。复合中药方剂可从多种途径发挥抗菌作用[11-14]。黄连解毒汤最早记载于《肘后备急方》，方剂以黄连为君，黄柏为臣，配以黄芩、栀子，通泄三焦之火，是清热解毒的代表方。现代医学研究表明，黄连解毒汤具有抗炎[15]，控制血糖[16]，降血脂改善动脉粥样硬化[17]等功效。在前期细菌体外培养实验，证实黄连解毒汤草药的提取物对铜绿假单胞菌生长具有抑制作用。而在临床工作中，我们发现黄连解毒汤全方剂对改善细菌性肺炎患者喘憋、呼吸困难等症状具有良好作用；且与单独使用抗生素的患者相比，联合应用黄连解毒汤的患者的白细胞、C反应蛋白（CRP）等感染、炎症指标明显下降，有统计学意义。有文献研究表明，黄连解毒汤联合抗菌药物能够降低体外杀灭PA抗菌药物使用浓度[18]。本研究旨通过小鼠模型探究黄连解毒汤的抗铜绿假单胞菌机制。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料 铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa O1，ATCC.PA15692）。8周龄BABL/c小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）。LB培养基（Merck®VetecTM），MH培养基（Merck® VetecTM）。PA菌液接种至LB培养基，37 ℃，200 r/min培养16 h，取出菌液调整至0.5麦氏浊度待用。黄连解毒汤药材（黄连、黄柏、黄芩、栀子）购于同仁堂，过滤灭菌制成原液，以黄连计1 280 mg/mL；麦氏浊度计（中国食品药品检定研究院），细胞因子试剂盒（BD552364,BD Biosciences,USA），细菌总RNA提取试剂盒（天根DP430），Reverse Transcription System（A3500,Promega,USA），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201,TOYOBO,Japan）。

2.2 黄连解毒汤对铜绿假单胞菌相关基因的影响

2.2.1 最低抑菌浓度MIC测定 黄连解毒汤、头孢他啶以MH培养基按照倍比稀释法分别加入96孔板，每孔50 μL，每组8个复孔。通过前期工作经验，黄连解毒汤（1 280 mg/mL，以黄连计）、头孢他啶（1 024 μg/mL）配制初始浓度母液，以MH培养基倍比稀释11个浓度，每孔50 μL。0.5麦氏浊度的铜绿假单胞菌液用MH培养基稀释100倍后加入上述96孔板，每孔50 μL。空白组为稀释后的菌液和不含药MH培养基。37 ℃培养16 h后观察细菌抑制状况，确定黄连解毒汤和头孢他啶的最低抑菌浓度。

2.2.2 黄连解毒汤对mucA、mraY、algD基因的影响 根据MIC值确定黄连解毒汤和头孢他啶浓度作用于铜绿假单胞菌，使用MH培养基，37 ℃，200 r/min培养6 h及16 h后提取细菌总RNA，RT-PCR测定。引物序列见表1。药物分组：空白、头孢他啶、黄连解毒汤及黄连解毒汤加头孢他啶。

表1 引物序列

2.3 黄连解毒汤对小鼠铜绿假单胞菌下呼吸道感染的治疗

2.3.1 铜绿假单胞菌下呼吸道感染小鼠模型的建立 96只同窝8周龄BABL/c小鼠SPF环境饲养。小鼠随机分为4组（A.空白组，B.头孢他啶组，C.黄连解毒汤组，D.黄连解毒汤加头孢他啶组），各组雌雄各12只。无菌术条件下小鼠麻醉后，颈前切开暴露气管，其中B、C、D组向气管内注入0.5麦氏浊度的PA菌液10 μL，A组注入无菌生理盐水10 μL，缝合各层组织。

2.3.2 药物治疗与观察 通过前期实验和查阅资料，黄连解毒汤对小鼠细菌感染基本治疗浓度是700 mg/kg（以黄连计）[19]，头孢他啶对小鼠PA感染的治疗浓度是65 mg/kg[20]，黄连解毒汤与头孢他啶分别配制为1 500 mg/mL与500 mg/mL的母液。按体质量计算药液量，黄连解毒汤、头孢他啶均灌胃给药。空白组使用灭菌生理盐水代替药物。

2.3.3 组织病理检查与血液检查 于第3、第5天取小鼠全血，以抗凝管收集血液1 mL，CBA法测定细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6/10/12p70）。于第3、第10天解剖获取肺组织，制作石蜡切片，观察组织变化。

3 实验结果与分析

3.1 MIC值的测定 药物梯度96孔板培养16 h后观察细菌浊度，黄连解毒汤160 mg/mL（以黄连计）、头孢他啶8 μg/mL时，细菌生长被抑制。黄连解毒汤和头孢他啶的MIC分别为160 mg/mL和8 μg/mL。后续实验将以这2个浓度为基础。

3.2 联合用药 可以抑制mucA、mraY、algD等基因的表达 。如表2（培养6 h）和表3（培养16 h）所示，黄连解毒汤加强了头孢他啶对mraY表达的抑制作用。同时，与黄连解毒汤共培养后明显抑制了mucA和algD基因的表达，并且在与头孢他啶联合用药后，上述两基因的表达抑制更加明显（P＜0.05），头孢他啶能够加强黄连解毒汤对mucA和algD两种基因表达的抑制。数据为至少3次独立实验的平均值（平均值±标准差）。

表2 mucA、mraY、algD表达 （第6小时取样测定）（，n =3）

表2 mucA、mraY、algD表达 （第6小时取样测定）（，n =3）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；## P ＜0.01

表3 mucA、mraY、algD表达 （第16小时取样测定）（，n =3）

表3 mucA、mraY、algD表达 （第16小时取样测定）（，n =3）

注：与空白组比较，### P ＜0.001

3.3 铜绿假单胞菌下呼吸道感染小鼠模型的治疗实验

3.3.1 联合用药可以降低血液中炎性因子群的含量 PAP小鼠治疗实验，在第3、第5天各治疗方案血液炎性因子检测结果分别如表4、表5所示。取样的2个时间点检测结果显示，与单独使用头孢他啶或黄连解毒汤治疗相比，两者联合用药治疗后，各取样时间点血液中TNF-α，IFN-γ，IL-6/10/12p70等炎性因子下降效果显著。且黄连解毒汤组的TNF-α、IL-6、IL-10等指标显著低于头孢他啶组。黄连解毒汤具有辅助头孢他啶进行抗炎治疗的作用。

表4 血浆炎性因子群的表达（3 d）（，n =3）

表4 血浆炎性因子群的表达（3 d）（，n =3）

注：与头孢他啶组或黄连解毒汤组比较，# P ＜0.05；与头孢他啶组比较，△P ＜0.05

表5 血浆炎性因子群的表达（5 d）（，n =3）

表5 血浆炎性因子群的表达（5 d）（，n =3）

注：与头孢他啶组或黄连解毒汤组比较，# P ＜0.05；与头孢他啶组比较，△P ＜0.05

3.3.2 联合用药可以加快肺组织肿胀恢复和炎症消退 小鼠肺脏不同时间点石蜡切片HE染色结果图1所示，由图可见，单独应用黄连解毒汤治疗，与头孢他啶相比，第3天时肺泡间隔肿胀略严重，但炎细胞浸润更少。而联合用药组在第10天时组织肿胀和炎细胞浸润均优于单独应用头孢他啶组，肺泡形态基本接近阴性对照（正常）。

4 讨论

图1 小鼠PA感染肺石蜡切片HE染色

黄连解毒汤作为清热解毒的中药经典方剂。PA肺炎小鼠模型治疗实验中，与单纯使用头孢他啶相比，黄莲解毒汤联合头孢他啶治疗后，小鼠血液中炎性指标明显下降，肺组织肿胀和炎细胞浸润程度明显减轻且恢复较快。联合用药组小鼠进食、饮水及其他活动明显多于其他组。说明黄连解毒汤对小鼠PA下呼吸道感染具有治疗作用。

研究表明，黄连解毒汤方剂能有效抑制IL-2、TNF-α、IFN-γ 等炎性因子的形成[21]，其内栀子苷、黄芩苷等单药有效成分亦有一定的抗炎作用[22]。有研究认为，抗炎作用可能是通过调节相关代谢产物和酶，从而影响巨噬细胞炎性反应[23]。本研究中，PA肺炎小鼠通过单独使用黄连解毒汤治疗，其中一些炎性因子例如TNF-α，IL-6/10等甚至低于单纯抗生素治疗组。前期实验中我们发现，无论药物治疗还是自然病程，在第3天时血液炎症指标达到最高峰。联合用药组中，第5天时，各种炎性指标明显低于单独用药组，肺组织切片中，单独应用黄连解毒汤或与头孢他啶联合应用，在10天时肺部炎细胞浸润少于单独应用头孢他啶组。这些现象证明黄连解毒汤本身具有抗炎作用，与文献报道一致[21-23]。而且这种抗炎作用能够加强头孢他啶的治疗效果，这对于促进呼吸困难、喘憋等炎性浸润症状的缓解，特别是改善高龄患者预后具有重要意义。

铜绿假单胞菌（PA）是假单胞菌属的代表菌，其特征是需氧有鞭毛，无芽孢，无荚膜。引起PA产生多重耐药的机制主要包括：1）分泌β-内酰胺酶等蛋白酶类降解抗生素；2）通过增加主动外排药物和减少膜孔蛋白等方式降低细胞膜通透性，使药物难以进入细胞内；3）药物作用位点突变，使药物作用位点（如氟喹诺酮类杀菌重要位点拓扑异构酶II）不再能与药物稳定结合；4）生物膜的形成[9,24]。

为研究黄连解毒汤对PA的抗菌作用和可能机制，根据我们的前期研究以及查阅相关资料，选择了观察mucA、mraY、algD等3种基因在治疗过程中的表达状况。磷酸-N-乙酰胞壁酸酯-胸腺喷丁转位酶（mraY）是PA细胞壁主要成分肽聚糖合成的重要酶，可作为细胞壁合成的标志[25-26]。mucA基因与PA菌生物膜形成[24,27]、特别是生物膜重要成分藻酸盐合成[28]相关。algD基因则是与PA藻酸盐合成相关的直接基因[29-30]，处于mucA基因下游，有文献报道，mucA基因突变可导致algD基因表达去阻遏，藻酸盐过量表达[31]。因此，algD与mucA基因一起，可作为PA生物膜形成的标志物。

生物膜是包被于外界物体表面（在本实验中是包被于感染的肺组织之外）的复杂细菌组织，包括实现复杂物质互通的细菌群落及其分泌的蛋白质、多糖、肽聚糖等形成的覆盖于其表面的复杂黏液被膜。生物膜具有复杂的代谢过程，对于抗生素和受感染宿主的本身免疫反应具有很强的抵抗力，破坏生物膜的稳定性能够大大减少细菌的耐药程度[32-33]。

头孢他啶是第三代头孢菌素，其杀菌原理和其他β-内酰胺类抗生素一致，抑制细菌细胞壁的合成。药物共培养试验可见。头孢他啶组mraY基因表达明显下降，杀菌原理与文献报道一致[34]。而黄连解毒汤与PA菌共培养后，无论是否联合头孢他啶，mucA、algD两组基因表达均较阴性、阳性对照组明显下降。证明黄连解毒汤能够通过抑制藻酸盐的合成从而破坏PA细菌生物膜的形成，达到杀菌的作用。

黄连解毒汤对PA下呼吸道感染小鼠具有治疗作用，该方能够通过破坏PA细菌生物膜的稳定性起到杀菌作用，联合头孢他啶使用时明显增强抗菌效果；同时能够通过抗炎作用，缓解PA感染带来的机体炎症反应，促进症状缓解，减少病死率。