甘草黄酮的提取工艺优化、含量测定及体外抗氧化活性研究

张光辉，张 拴，靳如意，孟庆华

(陕西中医药大学药学院，陕西 西安 712046)

甘草在我国主要分布在内蒙、甘肃、新疆等地[1]，具有益气补脾、止咳祛痰、调和诸药等功用[2-4]。甘草含有三萜皂苷类和黄酮类[5-7]等活性成分，其中黄酮类包括甘草素、甘草苷、异甘草苷、异甘草素等[8-10]。研究发现，甘草黄酮不但对金黄色葡萄球菌[11]、链球菌[12]等细菌具有抑制作用，还具有解痉、保肝[13]、抗衰老、防治心血管疾病等功效[14]，可作为防治心脑血管疾病的天然药物和膳食补充剂[15]。目前，市场上甘草质量参差不齐，而甘草黄酮含量及抗氧化活性是衡量甘草质量的标准之一。因此，作者采用响应面法对甘草黄酮的提取工艺进行优化，并对不同产地甘草黄酮的含量及体外抗氧化活性进行比较，以期为甘草原产地鉴别及质量评价提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

内蒙古甘草，北京康美制药有限公司；甘肃甘草、新疆甘草，陕西兴盛德药业有限责任公司。

芦丁标准品；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇等均为分析纯；DPPH自由基，分析纯，上海源叶生物科技有限公司。

1102型紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司；HJ-3A型数显恒温磁力搅拌器，常州丹瑞实验仪器设备有限公司；HX502T型电子天平，慈溪天东衡器厂。

1.2 溶液的配制

称取亚硝酸钠2.50 g，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，配制成质量浓度为5%的亚硝酸钠溶液；称取硝酸铝5.00 g，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，配制成质量浓度为10%的硝酸铝溶液；称取氢氧化钠2.00 g，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，配制成质量浓度为4%的氢氧化钠溶液。

精密称取芦丁标准品0.005 0 g，用95%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，即得0.10 mg·mL-1的芦丁标准溶液，室温遮光保存，备用。

1.3 芦丁标准曲线的绘制

精密吸取芦丁标准溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中；滴加0.30 mL 5%亚硝酸钠溶液，静置3 min；再滴加0.30 mL 10%硝酸铝溶液，静置6 min后充分反应；最后滴加2.00 mL 4%氢氧化钠溶液[16]，摇匀，用95%乙醇定容至10 mL，静置10 min；用紫外可见分光光度计测定507 nm处吸光度[17]。以芦丁浓度(mg·mL-1)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.4 甘草黄酮的提取

准确称取甘草0.50 g，按一定液料比(mL∶g，下同)加入95%乙醇，在一定温度下提取一定时间，即得甘草黄酮提取液，将提取液定容至50 mL，备用。

1.5 提取工艺优化

以提取温度(A)、提取时间(B)、液料比(C)为自变量，以甘草黄酮提取率为考核指标，设计3因素3水平响应面实验，对甘草黄酮提取工艺进行优化。响应面实验的因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

1.6 甘草黄酮含量测定

取5.0 mL甘草黄酮提取液置于10 mL容量瓶中，按1.3方法测定507 nm处吸光度(A)，按式(1)计算甘草黄酮含量(mg·g-1)：

(1)

1.7 体外抗氧化活性研究

精密称取避光冷藏的DPPH自由基粉末0.005 0 g，加入无水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，得到0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液，避光保存，备用。

取甘草黄酮提取液，配制成0.005 4 mg·mL-1的甘草黄酮标准溶液；取2.00 mL标准溶液，滴加2.00 mL 0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液，避光放置30 min后测定吸光度(A测)；以2.00 mL 95%乙醇滴加2.00 mL 0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液为参比(A参)。按式(2)计算DPPH自由基清除率(%)[18]。

(2)

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线(图1)

图1 芦丁标准曲线

对标准曲线进行拟合，得线性回归方程：y=9.2771x+0.0026，R2=0.9956>0.99。表明，芦丁溶液浓度在0.00～0.05 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

2.2 最优提取工艺

采用响应面法优化甘草黄酮提取工艺，结果见表2，方差分析见表3。

表2 响应面实验结果

表3 方差分析

对表2数据进行拟合，得到多元二次回归模型：Y=1.68-0.21A+0.084B+0.13C-0.20AB+0.13AC+0.025BC-0.14A2-0.072B2-0.035C2。

从表3可知，失拟项P=0.1193>0.05，说明没有失拟因素；根据F值可知，3个因素对甘草黄酮提取率的影响大小依次为：液料比>提取时间>提取温度。

提取温度、提取时间、液料比交互作用对甘草黄酮提取率影响的响应曲面图如图2所示。

从图2可知，响应面法优化的最优提取工艺为：提取温度86.7 ℃、提取时间4.0 h、液料比为80.0∶1.0。

图2 各因素交互作用对甘草黄酮提取率影响的响应曲面图

2.3 最优提取工艺方法学考察

2.3.1 精密度

称取甘草0.50 g，在最优工艺条件下提取，提取液定容至50 mL容量瓶中。取2.00 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3方法连续测定5次吸光度，分别为0.342、0.345、0.341、0.342、0.339。计算RSD为0.22%(n=5)，表明该提取工艺精密度良好。

2.3.2 重复性

称取5份甘草各0.50 g，在最优工艺条件下提取，提取液定容至50 mL容量瓶中。分别取2.00 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3方法测定吸光度，分别为0.342、0.346、0.338、0.340、0.344。计算RSD为0.32%(n=5)，表明该提取工艺重复性良好。

2.3.3 稳定性

称取甘草0.50 g，在最优工艺条件下提取，提取液定容至50 mL容量瓶中。每隔20 min取2.00 mL置于10 mL容量瓶中，按1.3方法测定吸光度，分别为0.347、0.342、0.339、0.338、0.335。计算RSD为0.46%(n=5)，表明该提取工艺稳定性较好。

2.4 不同产地甘草黄酮含量对比

在最优工艺条件下，采用醇提法提取内蒙古、新疆、甘肃等地甘草中的黄酮。取5.0 mL不同产地甘草黄酮提取液置于10 mL容量瓶中，按1.3方法测定507 nm处吸光度，计算甘草黄酮含量，结果见表4。

表4 不同产地甘草黄酮含量对比

从表4可知，在最优工艺条件下，采用醇提法提取不同产地甘草中的黄酮，其中甘肃甘草黄酮含量最高，平均值达到18.22 mg·g-1，其次为新疆甘草黄酮，内蒙古甘草黄酮的含量最低。

2.5 体外抗氧化活性研究方法学考察

2.5.1 精密度

取2.00 mL甘肃甘草黄酮提取液，滴加2.00 mL DPPH自由基溶液，避光反应30 min[19]，以2.00 mL乙醇与2.00 mL DPPH自由基混合溶液为对照，以乙醇校零于517 nm[20]处连续测定5次吸光度。计算DPPH自由基清除率分别为63.81%、63.81%、63.97%、63.75%、63.97%，RSD为0.10%(n=5)，表明体外抗氧化活性研究方法精密度良好。

2.5.2 稳定性

取2.00 mL甘肃甘草黄酮提取液，滴加2.00 mL DPPH自由基溶液，避光反应30 min，以2.00 mL乙醇与2.00 mL DPPH自由基混合溶液为对照，分别于0 min、5 min、10 min、15 min、20 min以乙醇校零于517 nm处测定吸光度。计算DPPH自由基清除率分别为63.81%、63.81%、64.03%、63.33%、63.49%，RSD为0.28%(n=5)，表明DPPH自由基清除率在20 min内稳定，体外抗氧化活性研究方法稳定性良好。

2.5.3 重复性

取5份甘肃甘草黄酮提取液，每份2.00 mL，分别滴加2.00 mL DPPH自由基溶液，避光反应30 min，以2.00 mL乙醇与2.00 mL DPPH自由基混合溶液为对照，以乙醇校零于517 nm处测定吸光度。计算DPPH自由基清除率分别为63.97%、63.49%、63.81%、63.87%、63.97%，RSD为0.63%(n=5)，表明体外抗氧化活性研究方法重复性良好。

2.6 不同产地甘草黄酮的体外抗氧化活性对比

分别取2.00 mL 0.005 4 mg·mL-1的不同产地甘草黄酮标准溶液，滴加2.00 mL 0.05 mg·mL-1DPPH自由基溶液，避光反应30 min后测定517 nm处吸光度，计算DPPH自由基清除率，结果见表5。

表5 不同产地甘草黄酮的体外抗氧化活性对比

从表5可知，相同浓度下，内蒙古甘草黄酮的体外抗氧化活性最差，甘肃和新疆的甘草黄酮的体外抗氧化活性相近。

3 结论

采用响应面法对甘草黄酮的醇提法提取工艺进行优化，最优提取工艺条件为：提取温度86.7 ℃、提取时间4.0 h、液料比80.0∶1.0(mL∶g)。3个产地甘草黄酮含量大小依次为：甘肃>新疆>内蒙古，分别为18.22 mg·g-1、17.75 mg·g-1、16.82 mg·g-1。3个产地甘草黄酮的体外抗氧化活性大小依次为：甘肃>新疆>内蒙古，对DPPH自由基的清除率分别为63.82%、62.74%、51.41%。此结论可作为甘草原产地鉴别及质量评价的参考依据之一，为甘草药材的开发利用提供帮助。