复方丹参滴丸通过JAK-STAT 通路对癫痫模型大鼠的保护机制研究

赵 宇，刘 洋

(四川大学华西医院特需医疗中心，四川 成都 614000)

癫痫是临床常见的慢性、进行性、反复性神经系统疾病，患病率仅次于脑血管疾病，患者大脑神经细胞过度异常放电可导致短暂性大脑功能障碍，造成海马神经元损伤，损害其认知功能，并引发患者焦虑、抑郁等心理障碍，严重威胁其身心健康，给社会和家庭带来沉重负担[1-2]。目前，临床主要应用丙戊酸钠、卡马西平及左乙拉西坦等抗癫痫药治疗该病，但存在疗效较差、易形成耐受性和毒副作用大等缺点，而中药可弥补这些缺陷，在癫痫治疗中发挥着重要作用。复方丹参滴丸可活血化瘀、理气止痛，能减轻炎症反应，控制癫痫发作，改善学习记忆功能、修复海马神经元损伤，在临床上被广泛用于治疗癫痫，但其药理机制目前尚不清楚[3-4]。癫痫的病理机制复杂，其中小胶质细胞及星形胶质细胞活化促使炎症因子产生，导致神经炎症是其主要发病机制[5]。JAK/STAT3信号可介导神经炎症过程，抑制其激活，可减少促炎因子产生，减轻神经炎症，预防癫痫的发生，缓解其病情发展[6-7]。另外，丹参酮 ⅡA可通过抑制JAK/STAT信号逆转心肌肥厚，且根据基因表达谱和分子指纹技术分析可知，调控JAK/STAT信号是复方丹参滴丸治疗颈动脉粥样硬化的作用机制[8-9]。因而，可推测复方丹参滴丸可能通过调控JAK-STAT 通路对癫痫模型大鼠发挥神经保护作用，本研究通过建立癫痫模型大鼠，对此进行研究。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，体重200～240 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，大鼠质量合格证号为 2015000504404，许可证号为SC-XK(沪)20082-005。所有大鼠在四川大学华西医院动物房中饲养，12 h/12 h交替光照，温度25 ℃，相对湿度50%，保持环境整洁、安静，通风良好，大鼠自由饮食、饮水。

1.2 药品、试剂与仪器

1.2.1 药品与试剂：复方丹参滴丸(天士力制药集团股份有限公司，批准文号：国药准字Z10950111)；托伐替尼(货号为HY-40354，美国MCE公司)；戊四氮(货号为P6500，上海赫果生物科技有限公司)；氯化锂(货号为S24112，上海源叶生物科技有限公司)；大鼠TNF-α 及IL-6酶联免疫吸附试剂盒、兔源JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3及GAPDH一抗、羊抗兔二抗(货号分别为ab100785、ab100772、ab39636、ab32101、ab68153、ab76315、ab181602、ab150077，美国Abcam公司)；RIPA裂解液、BCA试剂盒及HE染色试剂盒(货号分别为P0 013 K、P0011、C0105，上海碧云天公司)等。

1.2.2 仪器：Morris水迷宫视频分析系统(上海欣软信息科技有限公司，型号：XR-XC105)；轮转切片机、包埋机和烤片机(德国Leica 公司，型号：RM2035、EG1160和HI1220)；光学显微镜(日本尼康公司，型号：SMZ745)；酶标仪(德国Perkin Elmer公司，型号：XElx800)；低温高速离心机(德国 Eppendorf 股份公司，型号：Centrifuge 5424R)；蛋白电泳仪、半干转膜仪(美国Bio-Rad公司，型号：1659001、Trans-Blot SD)；凝胶成像仪(Miulab公司，型号：GIS-500)等。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及分组给药：参照文献制备动物模型[10]。SD大鼠以127 mg/kg剂量腹腔注射氯化锂；24 h后以35 mg/kg剂量腹腔注射戊四氮；30 min后，观察大鼠面肌抽动、前肢阵挛、后肢阵挛及跌倒等症状。根据Racine分级评价癫痫发作级别，Ⅰ级为面部出现阵挛；Ⅱ级为颈部肌肉痉挛，出现甩尾或节律性点头；Ⅲ级为出现单侧前肢抽搐；Ⅳ级为出现双前肢抽搐；Ⅴ级为出现四肢抽搐、失去平衡、跳跃及跌倒等[11]。如建模大鼠持续出现Ⅳ级以上癫痫发作表现，说明建模成功。建模52只，最终成功48只，随机分为模型组、复方丹参滴丸组、托伐替尼组及复方丹参滴丸+托伐替尼组，每组12只；另取12只SD大鼠腹腔注射等剂量无菌0.9%氯化钠溶液，设为对照组。将复方丹参滴丸[12]、托伐替尼[13]溶于0.9%氯化钠溶液分别配制为8、0.62 mg/ml溶液，复方丹参滴丸与托伐替尼均以10 ml/kg剂量灌胃，模型组与对照组以等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃，各组均1日1次，持续28 d。

1.3.2 大鼠癫痫发作情况检测：结束用药24 h后，观察各组大鼠癫痫发作情况，记录其1 d内发作次数、持续时间。

1.3.3 大鼠认知功能检测：大鼠癫痫发作情况检测结束后，参照文献进行Morris水迷宫实验[14]，测定平均逃避潜伏期及大鼠在1 min内穿越平台原位置的次数，以此评定大鼠认知功能。

1.3.4 大鼠海马神经元病理变化检测及标本采集：大鼠认知功能检测结束后，经尾静脉取血2 ml，静置后离心收集上清液，血清储存于-80 ℃备用。将大鼠处死，解剖取出大脑，以PBS冲洗干净后，剪取约0.5 g脑组织，加入蛋白裂解液后制备为匀浆液，离心收集上清液，提取得到总蛋白样品液；剩余组织置于4%多聚甲醛中固定，以梯度酒精(由低到高)脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，最后以切片机做病理切片；选取含有海马组织的病理切片脱蜡后，使用由高浓度到低浓度酒精浸泡处理；参照说明书的步骤以HE试剂盒进行染色，再次脱水、透明后封片，采用显微镜观察大鼠海马神经元病理变化，任选5个视野拍照。

1.3.5 大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平测定：取“1.3.4”项下冻存的血清置于4 ℃解冻，使用酶联免疫吸附试剂盒测定其中TNF-α、IL-6含量，具体操作按照说明书进行。

1.3.6 免疫印迹法：“1.3.4”项下冻存的蛋白样品液置于4 ℃冻融，参照说明书的步骤以BCA试剂盒测定其浓度；各组取含相同质量总蛋白样品液电泳分离蛋白，并将其转移至硝酸纤维膜上，使用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，截取目的蛋白条带置于小盒中，以兔源JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3及GAPDH一抗于4 ℃冰箱中孵育过夜，经TBST漂洗后，加入羊抗兔二抗，室温置于摇床上孵育2 h，以TBST再次漂洗，以增强化学发光法显色，采用凝胶成像仪拍摄蛋白条带，以Image Lab软件对其进行分析，得出蛋白相对表达。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 五组大鼠癫痫发作次数、持续时间比较

与对照组相比，模型组大鼠癫痫发作次数明显增多，持续时间明显延长；与模型组相比，复方丹参滴丸组、托伐替尼组及复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠癫痫发作次数明显减少，持续时间明显缩短；与复方丹参滴丸组、托伐替尼组分别相比，复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠癫痫发作次数明显减少，持续时间明显缩短，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 五组大鼠癫痫发作次数、持续时间比较Tab 1 Comparison of the frequency and duration of seizure

2.2 五组大鼠海马神经元病理变化

对照组大鼠海马神经元呈带状分布，细胞形态正常，结构清晰，胞浆透明，胞核规则呈圆形或椭圆形，核膜、核仁明显，染色质分布均匀，无病理变化；模型组大鼠海马神经元排列紊乱、疏松且失去正常结构，胞体变为三角形或不规则图形，胞质浓缩、深染，胞核固缩，核膜、核仁不明显，胞浆呈空泡样改变，细胞凋亡，数量显著减少等病理损伤；与模型组相比，复方丹参滴丸组、托伐替尼组及复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠海马神经元病理损伤减轻；与复方丹参滴丸组、托伐替尼组相比，复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠海马神经元病理损伤进一步减轻，见图1。

A.对照组；B.模型组；C.复方丹参滴丸组；D.托伐替尼组；E.复方丹参滴丸+托伐替尼组A.control group; B.model group; C.compound Danshen dripping pill group; D.tofacitinib group; E.compound Danshen dropping pill+tofacitinib group图1 HE染色检测五组大鼠海马神经元病理变化(×400)Fig 1 Pathological changes of hippocampal neurons in five groups of rats by HE staining (×400)

2.3 五组大鼠逃避潜伏期、穿越平台原位置次数比较

与对照组相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台原位置次数明显减少；与模型组相比，复方丹参滴丸组大鼠穿越平台原位置次数明显增多，托伐替尼组及复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越平台原位置次数明显增多；与复方丹参滴丸组、托伐替尼组分别相比，复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠穿越平台原位置次数明显增多，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 五组大鼠逃避潜伏期、穿越平台原位置次数比较Tab 2 Comparison of escape latency and times of traversing the original platform position among five groups

2.4 五组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较

与对照组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平明显升高；与模型组相比，复方丹参滴丸组、托伐替尼组及复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠血清TNF-α、IL-6水平明显降低；与复方丹参滴丸组、托伐替尼组分别相比，复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠血清TNF-α、IL-6水平明显降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 五组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较Tab 3 Comparison of serum TNFα-, IL-6 levels among

2.5 各组大鼠脑组织JAK/STAT通路相关蛋白表达比较

与对照组相比，模型组大鼠脑组织p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表达明显升高；与模型组相比，复方丹参滴丸组、托伐替尼组及复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠脑组织p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表达明显降低；与复方丹参滴丸组、托伐替尼组分别相比，复方丹参滴丸+托伐替尼组大鼠脑组织p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表达明显降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2、表4。

A.对照组；B.模型组；C.复方丹参滴丸组；D.托伐替尼组；E.复方丹参滴丸+托伐替尼组A.control group; B.model group; C.compound Danshen dripping pill group; D.tofacitinib group; E.compound Danshen dropping pill+tofacitinib group图2 免疫印迹检测五组大鼠脑组织JAK/STAT通路相关蛋白表达Fig 2 Expression of proteins associated with the JAK/STAT pathway in brain tissues of five groups by Western Blot

表4 五组大鼠脑组织JAK/STAT通路相关蛋白的相对表达比较Tab 4 Comparison of relative expression of proteins related to the JAK/STAT pathway in brain tissues of five groups

3 讨论

癫痫是一种慢性神经系统疾病，可长期反复发作，难以治愈，大多数患者需长期服药，甚至终身不能停药，严重影响患者的生活质量，甚至因焦虑、抑郁增加其患精神疾病的风险。近年来，癫痫发病人数逐年增加，因而关于癫痫研究具有重大的临床及社会意义[15]。神经胶质细胞激活，促使TNF-α、IL-6等促炎因子合成并释放，引发神经炎症，造成海马神经元损伤是癫痫的主要病理机制[16]。本研究以腹腔注射氯化锂及戊四氮方法建立癫痫模型，结果显示，模型组大鼠海马神经元呈现排列紊乱、疏松且失去正常结构，胞体变为三角形或不规则图形，胞质浓缩、深染，胞核固缩，核膜、核仁不明显，胞浆呈空泡样改变，细胞凋亡，数量显著减少等病理损伤症状；且大鼠癫痫发作次数明显增多，持续时间、逃避潜伏期明显延长，血清TNF-α及IL-6水平明显升高，穿越平台原位置次数明显减少。表明经氯化锂及戊四氮处理后，大鼠出现炎症反应，海马神经元及认知功能受损，出现癫痫典型临床症状，揭示模型建立成功。

中医认为，癫痫属“痫证”，病因病机复杂，风痰上扰，血瘀风阻，气机逆乱，引起清窍蒙蔽是其主要病机，治疗应以祛除痰阻、清痰化浊、活血化瘀及安心宁神为主。复方丹参滴丸由丹参、三七和冰片组成，具有止痛散结、活血通经和补心安神之功效，还可有效消除氧自由基，降低炎症因子水平，减轻脑部炎症，并减少神经兴奋递质释放，阻滞神经元异常放电，起到抗癫痫作用[4,17]。研究结果发现，激活JAK/STAT通路，可引发神经炎症，导致癫痫的发生，阻滞该通路激活对癫痫的治疗具有关键作用[18-19]。复方丹参滴丸的主要成分丹参可抑制JAK/STAT活化，减轻炎症反应，缓解肺纤维化进程[20]。因此，可推测复方丹参滴丸治疗癫痫的作用机制可能是通过下调JAK-STAT 通路实现。本研究结果显示，癫痫模型大鼠脑组织p-JAK/JAK及p-STAT3/STAT3表达明显升高；经复方丹参滴丸及托伐替尼处理后，JAK-STAT 通路蛋白磷酸化水平降低，且大鼠海马神经元病理损伤减轻，其癫痫发作次数减少，持续时间、逃避潜伏期缩短，血清TNF-α及IL-6水平降低，穿越平台原位置次数增多。表明癫痫大鼠JAK-STAT 通路处于激活状态，复方丹参滴丸可抑制JAK-STAT 通路磷酸化激活，与JAK抑制剂托伐替尼作用相似，均可降低促炎因子合成、分泌，抑制炎症反应，阻止癫痫发作，减轻海马神经元损伤，修复大鼠认知功能。复方丹参滴丸与托伐替尼联合处理模型大鼠，可进一步减轻大鼠海马神经元病理损伤，减少癫痫发作次数，缩短持续时间，降低血清TNF-α、IL-6水平和脑组织JAK、STAT3蛋白磷酸化水平，使大鼠穿越平台原位置次数增多。表明复方丹参滴丸与托伐替尼联合应用可协同下调JAK-STAT 信号磷酸化，抑制炎症发生，减轻海马神经元损伤及癫痫发作，修复受损认知功能，揭示抑制JAK/STAT3信号激活可能是复方丹参滴丸改善癫痫大鼠临床症状的药理机制之一。

综上所述，复方丹参滴丸可降低炎症因子合成、释放，抑制神经炎症发生，减少癫痫发作次数并缩短发作时间，促使认知功能恢复，改善癫痫大鼠临床症状，抑制JAK/STAT3信号激活可能是其作用机制之一。但本研究未使用JAK/STAT3通路激动剂进行对照验证，关于复方丹参滴丸治疗癫痫的药理机制的证据并不充分，还需要后续深入研究。