葛花总黄酮对链脲佐菌素诱导糖尿病视网膜病变小鼠玻璃体血管内皮生长因子及高迁移率族蛋白B1信号通路的影响Δ

凌佼佼，栾 兰，杨 芳，陆 璐，洪 斌

(十堰市人民医院(湖北医药学院附属人民医院)眼科，湖北 十堰442000)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常见的微血管并发症之一，也是导致成人失明的主要原因之一[1]。近年来,随着生活水平提高、饮食结构改变等，糖尿病的发病率不断升高，DR的发生率也随之升高。流行病学资料显示，我国DR的发病率为23.0%～43.0%，其中4.4%～8.2%的患者存在不同程度的视力受损，而因该病失明的患者每年高达1.2～2.4万例[2]。DR给患者的生活、工作造成了严重不良影响。DR一般包括非增生期和增生期2个阶段，非增生期视网膜以微动脉瘤出血、视网膜渗漏、相关神经细胞改变等为特征，增生期则以新生血管形成为主要特征。在治疗方面，目前临床上主要采用控制血糖、激光光凝、给予糖皮质激素、玻璃体切割术及神经保护等手段进行治疗[3]，取得了一定的治疗效果。但由于DR发病机制复杂，上述治疗无法完全控制病情进展，且毒副作用也较明显，因此，亟需寻找更为安全有效的药物防治DR。葛花总黄酮为中药葛花中提取的黄酮成分，杨芳等[4]的研究结果发现，其能改善DR小鼠视网膜的病理形态，保护视网膜。但类似研究仍然较少，本研究主要探讨葛花总黄酮对DR小鼠玻璃体血管内皮生长因子(VEGF)及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级健康雄性C57BL/6小鼠90只，周龄6周，体重20～24 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，动物生产许可证号为SCXK(京)2014-0011，饲养于湖北医药学院附属人民医院动物实验中心，动物实验使用许可证为SYXK(鄂)2016—0031。将小鼠置于塑料鼠盒内进行为期1周的适应性饲养，每盒5只。鼠舍内温度保持在(21±2)℃，相对湿度控制在(55±5)%，光照周期为12/12 h，噪音<60 dB，氨浓度<20 ppm，每小时换气8～20次，饲以灭菌的普通标准饲料及过滤水，保证食水充足，每周1次更换垫料、消毒。

1.1.2 主要药品与试剂：链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，CAS号为18883-66-4，纯度为≥98% (HPLC)，规格为每瓶100 mg，货号为S8050，购自上海恒斐生物科技有限公司；使用时采用柠檬酸缓冲液(pH=4.2)溶解配制成6 mg/ml的STZ溶液，现用现配。葛花药材，批号为170608，购自广东元德中药饮片有限公司；采用超声提取的方法提取药材中葛花总黄酮，使用时用二甲基亚砜(DMSO)溶解，0.9%氯化钠溶液稀释配制成质量浓度为5、10及20 mg/ml的葛花总黄酮溶液，现用现配。羟苯磺酸钙片，规格为每片0.5 g，批准文号为国药准字H20030087，批号为20170724，购自南京长澳制药有限公司；使用时研碎成末，用DMSO溶解，0.9%氯化钠溶液稀释配制成质量浓度为0.1 g/ml的羟苯磺酸钙溶液，现用现配。5%BSA封闭液、磷酸盐缓冲液(PBS)、含0.05% 吐温20的中性PBS(PBST)及TBST缓冲液均购自上海沪震实业有限公司。小鼠抗CD31单克隆抗体、小鼠抗HMGB1、肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠二抗及过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗均购自佰思诺(天津)生物科技有限公司。甘油明胶封片液购自武汉纯度生物科技有限公司。小鼠VEGF、核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析检测试剂盒购自上海亿言生物科技有限公司。二奎琳甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自北京智杰方远科技有限公司。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液购自南京森贝伽生物科技有限公司。化学发光增强试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备：LABOSPECT 008 AS型全自动生化分析仪(日本日立公司)；APE ELITE型全自动酶免分析系统(德国DAS公司)；ROTOFIX32 A型离心机(德国Hettich公司)；DMi8型荧光显微镜(德国Leica公司)；SE300miniVE型电泳仪(美国Hoefer公司)；ChemiDoc MP型凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及实验方法：适应性饲养结束后，将所有小鼠编号，随机分为正常对照组15只及造模组75只。造模组小鼠腹腔注射6 mg/ml的STZ溶液0.1 ml/10 g，1日1次，连续注射3 d；正常对照组小鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液(pH=4.2)0.1 ml/10 g，1日1次，连续注射3 d。1周后禁食不禁水12 h，测定小鼠空腹血糖，若血糖>13.9 mmol/L即为糖尿病模型建立成功；继续喂养10周，视网膜电图检测a、b波振幅下降，即为DR模型建立成功；此过程中意外死亡或造模失败的小鼠及时补齐[5]。造模成功的小鼠依据血糖水平均匀分组，分为模型组、羟苯磺酸钙组及葛花总黄酮低、中及高剂量组，每组15只。模型组及正常对照组小鼠分别经口灌胃给予0.9%氯化钠溶液0.1 ml/10 g，1日1次；羟苯磺酸钙组灌胃给予0.1 g/ml的羟苯磺酸钙溶液0.1 ml/10 g，1日1次；葛花总黄酮低、中及高剂量组分别经口灌胃给予5、10及20 mg/ml的葛花总黄酮溶液0.1 ml/10 g，1日1次。各组小鼠均连续给药10周。

1.2.2 标本采集与处理：末次给药后次日24 h禁食水，采用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔，腹主动脉取血2 ml，3 000 r/min速度离心5 min，分离得到的血清保存于-20 ℃冰箱备检；处死小鼠，迅速摘取双侧眼球，右侧眼球沿角膜缘环形剪开，弃去晶状体、房水，采用注射器吸取玻璃体0.3 ml，加入无菌PBS混匀，4 ℃条件下以12 000 r/min速度离心10 min，获得的上清液冻存于-80 ℃冰箱备检；之后去除玻璃体，完整剥离视网膜，置于液氮内速冻，保存在-80 ℃冰箱用于后续蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测；左侧眼球置于4 ℃的4%多聚甲醛内固定，用于后续免疫荧光染色检测[6]。

1.2.3 血糖水平测定：测定空腹血糖水平，取出“1.2.2”中制备玻璃体上清液，迅速恢复至室温(25 ℃)，采用LABOSPECT 008 AS型全自动生化分析仪，通过葡萄糖氧化酶法测定血糖水平。

1.2.4 免疫荧光染色法观察视网膜血管密度：“1.2.2”中的左侧眼球在4%多聚甲醛内固定16 h→去除玻璃体及晶状体，完整剥离视网膜→PBS洗涤2 min×2 次→常温下，置于5%BSA封闭液内封闭2 h→4 ℃条件下，视网膜置于CD31抗体工作液(1∶100稀释)内孵育2 d→PBST洗涤15 min×6次→室温下，视网膜置于FITC标记的羊抗鼠二抗工作液(1∶100稀释)内，避光摇床孵育2 h→PBST洗涤15 min×6次→视网膜平铺于载玻片上，剪成4瓣→甘油明胶封片液封片→滴加抗荧光猝灭剂，加盖盖玻片→晾干；在荧光显微镜下观察、拍照，并计数视网膜血管密度[7]。

1.2.5 酶联免疫吸附法检测玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平：取出“1.2.2”中制备玻璃体上清液，迅速恢复至室温，按照试剂盒说明书操作，采用APE ELITE型全自动酶免分析系统测定玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平[7]。

1.2.6 Western Blot法测定视网膜HMGB1蛋白表达水平：取出“1.2.2”中冻存的视网膜→液氮内研磨粉碎→4 ℃条件下，加入细胞裂解液150 μl+蛋白酶抑制剂10 μl，反应15 min→采用超声破碎组织5 min→12 000 r/min速度离心10 min，取上清液→用BCA法蛋白定量试剂盒测定样本蛋白含量→配制SDS-PAGE凝胶及电泳缓冲液，将分离胶和浓缩胶灌注浸进入电泳仪内→取蛋白样品80 μg与5×上缓冲液混匀→煮沸10 min使蛋白变性，上样→电泳，条件为浓缩胶60 V、3 h，分离胶120 V，至溴酚兰跑至分离胶最底部→将分离的目的蛋白转移至PVDF膜上→TBST缓冲液洗涤3 min→封闭液室温封闭2 h→4 ℃条件下，分别置于HMGB1、β-actin抗体工作液(1∶100稀释)内孵育过夜→TBST缓冲液洗涤15 min×4次→37 ℃条件下，置于过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液(1∶1 000稀释)内孵育2 h→TBST缓冲液洗涤15 min×4次→在暗室内，用电化学发光试剂盒显影、定影→清水冲洗，晾干；采用ChemiDoc MP型凝胶成像系统扫描胶片并拍照，之后采用Quantity One软件分析各蛋白条带光密度(OD)，计算HMGB1蛋白与内参β-actin OD值的比值，分析HMGB1蛋白的相对表达水平[8]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 六组小鼠治疗前后血糖水平比较

与正常对照组比较，模型组小鼠血糖水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛花总黄酮低、中及高剂量组和羟苯磺酸钙组小鼠血糖水平明显降低，且葛花总黄酮低剂量组>葛花总黄酮中剂量组>葛花总黄酮高剂量组和羟苯磺酸钙组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 六组小鼠治疗前后血糖水平比较Tab 1 Comparison of blood glucose levels among six groups of mice before and after treatment

2.2 六组小鼠视网膜血管密度比较

免疫荧光染色结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠视网膜血管密度明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛花总黄酮低、中及高剂量组和羟苯磺酸钙组小鼠视网膜血管密度明显降低，且葛花总黄酮低剂量组>葛花总黄酮中剂量组>葛花总黄酮高剂量组和羟苯磺酸钙组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图1。

表2 六组小鼠视网膜血管密度比较Tab 2 Comparison of retinal vascular density among

A.对照组；B.模型组；C.葛花总黄酮低剂量组；D.葛花总黄酮中剂量组；E.葛花总黄酮高剂量组；F.羟苯磺酸钙组A. control group; B. model group; C. total flavonoids extracted from puerariae flos low-concentration group; D. total flavonoids extracted from puerariae flos medium-concentration group; E. total flavonoids extracted from puerariae flos high-concentration group; F. calcium dobesilate group图1 六组小鼠视网膜血管免疫荧光染色结果(×100)Fig 1 Immunofluorescence staining of retinal vessels in six groups (×100)

2.3 六组小鼠玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平比较

与正常对照组比较，模型组小鼠玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛花总黄酮低、中及高剂量组和羟苯磺酸钙组小鼠玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平明显降低，且葛花总黄酮低剂量组>葛花总黄酮中剂量组>葛花总黄酮高剂量组和羟苯磺酸钙组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 六组小鼠玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平比较Tab 3 Comparison of vitreous VEGF, NF-κB and TNF-α levels among six groups

2.4 六组小鼠视网膜HMGB1蛋白表达水平比较

与正常对照组比较，模型组小鼠视网膜血管密度水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，葛花总黄酮低、中及高剂量组和羟苯磺酸钙组小鼠视网膜血管密度明显降低，且葛花总黄酮低剂量组>葛花总黄酮中剂量组>葛花总黄酮高剂量组和羟苯磺酸钙组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图2。

表4 六组小鼠视网膜HMGB1蛋白表达水平比较Tab 4 Comparison of HMGB1 protein expression levels

3 讨论

DR主要表现为黄斑水肿、视网膜新生血管生成[9]，其是目前全球范围内致盲的主要原因之一，近年来发病率日益升高，引起医学界广泛关注。DR的发生受到年龄、糖尿病病程、血糖水平、血脂水平、总胆固醇水平和尿微量蛋白等多种危险因素的共同影响[10]。DR的发病机制未完全明确，张思琴等[11]的研究结果认为，该过程可以涉及到多元醇通路活跃、二酰甘油-蛋白激酶C通路活化、胰岛素样生长因子-1及VEGF等生长因子释放、非酶糖基化终末产物累积及氧化应激损伤等各种途径，其中VEGF等生长因子与新生血管形成有关，是目前研究的热点。对于DR，临床上尚未有特效药物，而中医从整体出发，有丰富的治疗手段，许多中医药在DR的治疗方面取得了较好的效果，对于DR新型治疗药物的研究有重要意义[12]。

A.正常对照组；B.模型组；C.葛花总黄酮低剂量组；D.葛花总黄酮中剂量组；E.葛花总黄酮高剂量组；F.羟苯磺酸钙组A. control group; B. model group; C. total flavonoids extracted from puerariae flos low-concentration group; D. total flavonoids extracted from puerariae flos medium-concentration group; E. total flavonoids extracted from puerariae flos high-concentration group; F. calcium dobesilate group图2 Western-blot法检测六组小鼠视网膜HMGB1蛋白表达结果Fig 2 Results of HMGB1 protein expression of six groups by Western-blot method

葛花总黄酮是提取自葛花中的黄酮类化合物，药理研究结果显示，其具有解酒护肝、调节血糖血脂、抗肿瘤、胃黏膜保护、抗过敏、抗幽门螺杆菌、抗氧化应激及细胞保护等多种作用[13]。在DR的治疗方面，艾明等[14]已经用不同剂量的葛花总黄酮对糖尿病小鼠进行干预，发现葛花总黄酮能通过提高视网膜抗氧化能力、减轻氧化损伤来保护DR小鼠视网膜。本研究采用STZ注射法成功建立了小鼠DR模型，之后采用不同浓度的葛花总黄酮进行治疗，结果发现，与模型组比较，各用药组小鼠血糖水平较低，且葛花总黄酮低剂量组>葛花总黄酮中剂量组>葛花总黄酮高剂量组和羟苯磺酸钙组，差异均有统计学意义(P<0.05)。空腹血糖升高是DR发生发展的独立危险因素，控制血糖是逆转早期非增生性视网膜损伤、晚期防止病情进一步进展的主要手段[15]。本研究结果表明，葛花总黄酮具有较好的血糖控制作用，且药物浓度越高，降糖效果越好。

视网膜病理性血管增生是增殖期DR的主要特征，新生血管可生长伸入玻璃体腔内，破坏视网膜屏障，引起玻璃体出血，视网膜被牵引可最终出现失明[15]。抑制血管增生是改善病情的关键。本研究采用免疫荧光染色法观察视网膜新生血管变化，结果发现，与模型组比较，各用药组小鼠视网膜血管密度均较低，且葛花总黄酮高剂量组和羟苯磺酸钙组最低，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明高浓度的葛花总黄酮能有效抑制DR小鼠视网膜新生血管形成，治疗效果确切。

HMGB1属于一种染色质非组蛋白核蛋白，在所有真核细胞胞质内均有分布，参与细胞生长、增殖和分化等过程，在多种疾病的新生血管生成和组织细胞凋亡中起到重要作用。有研究结果显示，HMGB1在DR患者视网膜及玻璃体液中表达上调，能主导血管生成及炎症反应[16]。HMGB1上调能促进VEGF、NF-κB及TNF-α表达。VEGF为血管内皮强效特异性刺激因子，能够与细胞表面受体结合，促进内皮细胞增生、迁移，加速血管形成，同时能增加视网膜毛细血管通透性，诱发视网膜出血、渗出，是导致DR微血管病变的关键因素之一[17]。NF-κB 和TNF-α均为炎症反应相关因子，HMGB1能够通过晚期糖基化终产物受体和Toll样受体2种信号转导途径上调NF-κB表达，并进一步促进TNF-α合成、分泌，诱发和放大炎症反应，一方面直接损伤视网膜，另一方面也可以刺激VEGF等因子释放，加速血管增殖[18]。本研究结果显示，与模型组比较，各用药组小鼠玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平较低，视网膜HMGB1蛋白表达水平较低，且葛花总黄酮高剂量组和羟苯磺酸钙组最低，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明葛花总黄酮能下调HMGB1蛋白表达，同时抑制HMGB1通路血管生成及炎症反应相关因子VEGF、NF-κB及TNF-α表达，这可能是葛花总黄酮减轻DR小鼠视网膜血管增殖的作用机制之一。

综上所述，葛花总黄酮能降低糖尿病视网膜病变小鼠血糖水平，抑制视网膜血管异常增殖，降低玻璃体VEGF、NF-κB及TNF-α水平，呈剂量依赖性，其作用可能与抑制HMGB1信号通路活性有关。