梅州地区TLR4基因多态性与缺血性脑卒中发病风险的关联研究

刘远兴 周坤元 王士中 谢运泉 梁昊

急性缺血性脑卒中(急性脑梗死)是最常见的卒中类型，是由于脑部血管阻塞导致大脑缺血缺氧进而坏死[1]，占我国脑卒中的69.6%～70.8%[2]。急性期的时间划分尚不统一，一般指发病后2周内，轻型1周内，重型1个月内。我国住院急性缺血性脑卒中患者发病后1个月内病死率约为2.3%～3.2%，3个月时病死率9.0%～9.6%，致死/残疾率为34.5%～37.1%，1年病死率14.4%～15.4%，致死/残疾率33.4%～33.8%[2]。脑卒中的发生，是先天和后天因素共同作用的结果，其中基因的表达非常关键。有多项研究表明Toll样受体4(TLR4)表达与脑卒中的发生、发展存在显著关联[3-4]。rs10759932[5]和rs11536879[6]已证实与动脉粥样硬化和冠心病存在明显相关性。团队前期也通过Meta分析得出TLR4基因多态性(SNP)位点rs10759932、rs11536891、rs11536879与缺血性脑卒中再灌注损伤的发生相关[7]。此外，不同人种中TLR4基因rs1927914位点上的T等位基因对缺血性脑卒中的易感性不同，欧美人种T等位基因高时，更易出现缺血性脑卒中，但对于亚洲人口这一结论尚缺乏有效证据[8]。为此，我们检测梅州地区缺血性脑卒中患者和健康对照人群TLR4基因rs10759932、rs11536879、rs11536891、rs1927914 4个SNP位点的基因型，分析其与缺血性脑卒中的相关性，期望为脑卒中患者的防治提供临床依据。

1 对象和方法

1.1 观察对象收集2018年1月1日至2018年7月31日在中山大学附属梅州医院(广东省梅州市人民医院)住院治疗的梅州市籍贯首次突发缺血性脑卒中患者为病例组。纳入标准：(1)根据症状、体查、CT/MRI影像学检查等确诊，符合脑卒中TOAST病因分型和《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[9]；(2)受试者或其监护人同意签署知情同意书；(3)患者籍贯为梅州地区。排除标准：(1)因外伤、心律失常、脑血管畸形、肿瘤、血液疾病引起的脑卒中患者，特别注意剔除大动脉粥样硬化型与心源性栓塞造成的缺血性脑卒中患者；(2)患者无法配合或资料收集不全者。

收集同期在该院体检中心的梅州市籍贯体检健康者作为对照组。纳入标准：(1)经体检确认无脑卒中病史；(2)血压、血糖、血常规、肝肾功能均正常；(3)受试者同意签署知情同意书。排除标准：(1)体检发现曾患有或正患有严重疾病，如心梗、心衰、癌症等；(2)有精神病史；(3)阿尔茨海默病。

病例组共纳入病例194例，剔除资料缺失5例、脑部肿瘤2例、DNA样本不合格1例，共186例样本进入研究，其中男127例、女59例，发病年龄37～86岁，平均(66.8±11.0)岁；对照组共收纳入健康人202位，剔除资料缺失6位、患有其他心脑血管相关疾病2位，共194位健康样本进入研究，其中男101例、女93例，发病年龄40～81岁，平均(64.6±19.1)岁。病例组和对照组在性别、发病年龄、吸烟史、饮酒史等方面差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂及设备核酸自动提取仪(AU1001，BioTeKe Corpration)，NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher，USA)，Smart view pro 1100凝胶电泳成像仪、MP-300V 电泳仪(Major science)，ABI veriti-384 PCR仪(ABI)，384-well SpectroCHIP® bioarray芯片、MassARRAY Nanodispenser 点样机(RS1000，BIT Group)、MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪(MA4.2，Agena)等。ddH2O(ABI)、扩增引物和延伸引物混合物(Thermo)，25 mmol/L dNTP混合物、HotStar Taq(5 U/μL)、SAP Buffer、SAP Enzyme、iPLEX Buffer Plus、iPLEX Termination mix及iPLEX Enzyme(Agena，Inc)。

1.3 方法

1.3.1样品采集与准备：纳入研究的受试者均清晨空腹抽取5 mL静脉全血，以乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，冷冻保存。检测时，加入人红细胞裂解液，剧烈震荡 3 min，以12 000 r/min、离心半径15 cm离心30 s，弃上清，沉淀获取白细胞，提取血样中的DNA。使用NanoDrop2000进行吸光度值检测，1.25%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，DNA质检合格(琼脂糖电泳须有大于 10 kb 的明亮单一条带，且无 RNA 和蛋白污染)，转移至96孔板，-20℃储存备用。

表1 4个TLR4 SNP位点引物序列

1.3.2基因分析：(1)引物设计及合成：在NCBI网页(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中输入4个SNP位点的名称，按照dbSNP batch reportor格式显示，并在My agena网站中获取基因序列。结合公开发表过的关于该基因或该位点的文献并采用 AssayDesigner3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物(表1)，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

(2)基因分型检测：对所有样本的基因位点通过Agena MassArray系统进行基因分型检测。首先进行PCR扩增反应，继而进行产物碱性磷酸酶处理，之后进行单碱基延伸反应，最后进行树脂纯化和芯片点样。将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用MassARRAY TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，经两人核对检查数据文件的完整无误(各SNP的数据不为空，质谱无显著干扰、缺失，能明确分型)后将结果保存。

1.3.3数据分析：(1)可靠性分析：利用MassARRAY TYPER4.0软件根据DNA产物峰面积大小计算得到SNP位点所有分型点状图，正常聚类图中2个纯合子分型根据产物峰高分别在靠近横、纵轴聚类，在二者之间单独聚类的一组为杂合子，以此来确定SNP检测的可靠性。

(2)群体代表性分析：计算各组TLR4的4个位点基因型频率，经Haploview 4.2软件计算其是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡定律及最小等位基因频率(MAF)，以H-W方法P值及MAF值均>0.05认为符合群体代表性。

(3)回归分析及相关性分析：将基因型、发病年龄、性别、吸烟史纳入Logistic分析，确定基因型是否为危险因素。将病例组SNP基因型与发病年龄进行相关性分析，确定哪种基因型与发病年龄相关。

1.4 统计学处理采用SPSS21.0软件进行分析。计量资料若符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；位点基因型资料以频数表示，两组间SNP表达差异比较采用χ2检验；采用二分类Logistic 回归分析(经年龄、性别、吸烟史、饮酒史校正)统计分析各SNP位点基因型与患病风险的关系，计算值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)；以Spearman秩相关对SNP位点各基因型与年龄进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNP可靠性检测4种SNP聚类图中2个纯合子分型根据产物峰高分别在靠近横、纵轴聚类，在二者之间单独聚类的一组为杂合子，均为正常聚类图，表明检测结果可靠(图 1)。

图1 SNP分型聚类图

2.2 H-W平衡和MAF检验rs10759932位点有效样本374份，检出率98.42%；rs11536879位点有效样本376份，检出率98.95%；rs11536891位点有效样本374份，检出率98.42%；rs1927914位点有效样本366份，检出率96.32%。所有基因位点H-W平衡检验P值和MAF值均大于0.05。提示样本来自一个稳定的群体，具有群体代表性。详见表 2。

表2 H-W平衡和MAF检验结果

2.3 病例组与对照组中SNP位点各基因型分布比较TLR4 rs10759932 T/C基因型频率分布(χ2=3.692，P=0.158)、rs11536879 A/G基因型频率分布(χ2=0.615，P=0.735)和rs11536891 T/C基因型频率分布(χ2=1.975，P=0.373)差异均无统计学意义。rs1927914 A/G基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=9.267P=0.010)，对照组GG频率显著高于病例组(表3)。

二分类logistic回归分析显示，rs1927914 GG基因型发生脑梗死风险的概率是AA型的37.7%(校正OR=0.377，95%CI为0.189～0.750，P=0.005)；其余SNP位点基因型统计学差异均无统计学意义(表4)。

2.4 病例组SNP位点各基因型与发病年龄的相关性rs11536891基因型与发病年龄存在负相关(r=-0.156，P=0.035)，表明TC/CC基因型容易出现早发缺血性脑卒中。其余SNP位点基因型与发病年龄均无相关性(表5)。

表3 病例组与对照组SNP位点各基因型分布比较(n)

表4 SNP位点各基因型二分类Logistic分析结果

表5 病例组SNP位点各基因型与发病年龄的相关性结果

3 讨论

缺血性脑卒中的基因多态性的研究很大程度上受限于样本的例数大小和其遗传异质性。在目前已研究的相关基因多态性中，其遗传多态性亦存在明显的种族差异性，尽管基因多态性与脑梗死的相关性研究成果不尽一致，其分子遗传学研究对脑梗死的基因治疗以及脑梗死疾病易感人群的检测和早期防治提供依据[10]。缺血性脑卒中发生时，炎性反应在脑损伤的形成机制中起重要作用，既往已明确Toll样受体可以参与多种炎性细胞及分子的识别，是诱导炎性反应的关键因素；其中，TLR4广泛分布于小胶质细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞和神经元中，参与脑卒中后炎性脑损伤的病理过程。脑损伤后坏死细胞中释放的热休克蛋白等能激发TLR4介导的炎性反应，而进一步损伤的神经元产生的热休克蛋白60等能激活更多的TLR4及神经毒性受体形成恶性循环[11]。脑缺血时，TLR4显著升高，与相应配体结合，引起细胞内信号转导，促进细胞因子的合成和释放，通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途径介导炎性反应及凋亡[12]。

已有研究探讨了中国北方汉族人群基因多态性与缺血性脑卒中TOAST亚型的关系：rs1927911位点TT基因型频率在LAA组与对照组间差异有统计学意义(OR=0.652，95%CI=0.436～0.974，P=0.037)。rs2149356位点A等位基因频率在LAA组明显高于对照组(OR=1.413，95%CI=1.125～1.790，P=0.004)；rs1927914位点基因型频率及等位基因频率在LAA组与对照组间差异无统计学意义[13]。然而，Gu等[14]的研究则发现广西地区男性缺血性脑卒中患者的rs1927914基因多态性有统计学差异，其相关性如下：加性模型(additive model，AA + GGvs. AG)中患者OR(95%CI)为0.81(0.67～0.99)，P=0.039；等位基因模型(allele model，Avs. G)中患者OR(95%CI)为0.81(0.66～0.99)，P=0.037。这表明中国南、北方的汉族人群在缺血性脑卒中的发生机制上存在差异，也表明该病的发生是基因与环境共同作用的结果。本研究 也显示，rs1927914 A/G基因型频率分布在病例组和对照组差异有统计学意义(χ2=9.267，P=0.010)，病例组GG频率显著低于对照组。rs1927914 GG基因型发生脑卒中风险的概率是AA型的37.7%(校正OR=0.377，95%CI=0.189～0.750，P=0.005)。这与Gu等的研究报道一致。同时，本研究中首先对研究人群进行了H-W平衡和MAF检验，以确保所纳入的群体具备代表性。而且，为了保证数据结果的可靠性，按照纳入和排除标准，剔除了会严重干扰结果的病例。本研究还对所有检测样本进行了聚类图绘制，所有SNP位点的聚类图均显示出了良好的可靠性。

脑卒中疾病发生与年龄有显著相关性，年龄越大，发病风险越高[15]。高龄脑卒中患者可能只是衰老的表现，与基因因素相关性小，80岁以上的高龄脑卒中患者和40多岁的脑卒中患者发病机制可能不完全相同，年轻患者发生缺血性中风对社会和家庭带来的危害更大，可能长期致残，生活质量下降。本研究显示病例组rs11536891基因型与发病年龄存在负相关，即TC/CC基因型容易出现早发缺血性脑卒中。当然，本研究也存在很多不足，如病例数量不够大，可能影响实验结果；在检测过程中，某些样品检测失败，造成检出率无法达到100%，可能存在数据偏倚。

综上，本研究发现，rs1927914基因位点基因型与缺血性脑卒中的发生可能存在关联，G为该基因位点的保护基因；rs11536891基因型与缺血性脑卒中的发病年龄存在负相关，TC/CC基因型更容易出现早发缺血性脑卒中。目前流行病学和动物模型研究均表明脑梗死是遗传性疾病，但基因和环境的共同作用对脑卒中发病影响仍待研究。此外，与脑卒中相关的基因与发病年龄的相关性仍需要深入探讨，以便延缓脑卒中发病或及时救治。