急性冷应激对小鼠生理、生化指标的影响及麻黄汤的干预作用

徐光沛，杨 睿，章万君，吴书卉，朱 芸，韩春杨，刘翠艳 *

(1.兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室,安徽 合肥 230036；2.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

【研究意义】寒冷是一种重要的环境应激原。在畜禽养殖上，春冬季节防寒保暖难以得到有效保障，特别是北方高寒地区昼夜温差大，冷应激更加无法避免。冷应激可引起动物机体免疫力下降[1]、能量代谢紊乱、抗氧化功能受损[2]，影响动物的生产性能、繁殖性能，降低畜产品的质量甚至死亡[3]，是制约畜牧生产发展的重要因素之一[4-5]。因此，研究急性冷应激的致病特点、开发具有提高抗冷应激能力的药物，对于防治冷应激对机体的损害及其引发的多种疾病、保障畜禽的健康具有重要意义[6]。研究表明，中药可以提高机体冷适应能力，调节低温条件下机体特异和非特异性免疫功能，增强抗寒能力和加速冷适应的建立[7]。【前人研究进展】王娜等[6]将附子、当归、黄芪、五味子等中药饲喂雏鸡发现能提高冷应激状态下雏鸡的免疫水平和抗氧化能力；杨凤微[8]等试验发现，复方中药水提液(附子、黄芪、五味子)可显著提高慢性冷应激状态下雏鸡的抗氧化能力和白细胞数量。经典方剂麻黄汤出自张仲景的《伤寒论》，由麻黄、杏仁、桂枝、甘草组成，主治外感风寒表实证。现代临床应用表明，麻黄汤可以抗流行性感冒、急性支气管炎、支气管哮喘等[9-10]；药理学研究发现，麻黄汤具有明显的抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗过敏作用[11-14]，能显著提升寒冷应激小鼠的免疫功能[15]。【本研究切入点】麻黄汤对动物冷应激的防治效果及对急性冷应激状态下动物生理、生化指标的影响未见报道。【拟解决的关键问题】本试验通过动物病理模型，观察了麻黄汤对急性冷应激模型小鼠血液生理、血清生化及肝组织抗氧化能力的影响，以期为麻黄汤在畜禽冷应激方面的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康昆明种小鼠36只，体重(21±1)g，雄性，购自安徽医科大学实验动物中心。生产许可证号：SCXK(皖)2011-2012，饲养于清洁级动物房，温度(23±2)℃，相对湿度41 % ～ 60 %。

1.1.2 中药 麻黄、桂枝、杏仁、炙甘草，均购自合肥华佳大药房。

1.2 方法

1.2.1 麻黄汤水煎液的制备 取麻黄16 g、桂枝16 g、杏仁20 g、炙甘草8 g，混合后冷水浸泡40 min；武火煎至沸腾时，改用文火；共煎煮2次，合并滤液；浓缩至0.45 g/mL，4 ℃保存备用。

1.2.2 动物分组与处理 36只小鼠适应性饲养1 w后，随机分为空白组、模型组和麻黄汤给药组，每组12只。给药组按0.02 mL/g 体质量灌胃麻黄汤，其它组按同等剂量灌胃蒸馏水。造模前36 h第1次灌药/灌水，以后每隔12 h灌药/灌水1次，连续3次。末次灌胃2 h后，将模型组、给药组小鼠置于-20 ℃冷室中感受寒冷刺激，空白组小鼠室温放置。分别于放置1、2 h观察小鼠的精神状态、黏膜颜色等情况；试验结束时，所有小鼠眼球采血，摘取肝脏。肝组织于液氮保存备用。

1.2.3 指标检测 ① 血液生理指标。红细胞指数：红细胞(RBC)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞分布宽度(RDW)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血红蛋白浓度(HGB)；白细胞指数：白细胞(WBC)、淋巴细胞(Lymp)、单核细胞(Gran)、中性粒细胞(Mono)；血小板(PLT)。② 血清生化指标。血清尿素(urea)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血糖(Glu)、肌酸激酶(CK)含量(活性)。③ 肝组织抗氧化指标 取肝组织，低温匀浆处理，按照试剂盒说明操作，采用比色法检测肝组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)含量(活性)。

1.2.4 数据统计与分析 试验数据采用SPSS 21.0比较均值中的单因素进行分析，结果以均值±标准误(Mean±SEM)表示，同时比较各组之间的差异性，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 麻黄汤对冷应激小鼠精神状态、活动能力及皮肤色泽的影响

试验前，各组小鼠精神状态良好，活动正常，皮肤呈淡粉色，抓取时剧烈挣扎。试验1 h后，模型组小鼠精神不佳，皮肤呈粉红色，活动量减少，抓取时略有挣扎；而给药组小鼠精神状态良好，少量活动，皮肤呈淡粉色，抓取时有明显挣扎。试验2 h后，模型组小鼠精神萎靡，几乎不活动，身体蜷缩并伴有颤抖，皮肤轻度紫红，抓取时几乎不挣扎；给药组小鼠精神沉郁，皮肤潮红，抓取时仍有轻度挣扎。

2.2 麻黄汤对冷应激小鼠血液生理指标的影响

2.2.1 麻黄汤对冷应激小鼠红细胞指数的影响 由表1可知，与空白组相比，模型组和给药组的RBC、HGB、HCT值略微升高， MCV、MCHC值略微降低(P>0.05)；与模型组相比，给药组RBC、HCT、HGB的值升高，MCV、RDW、MCHC值降低(P>0.05)；比较各组的RBC、HCT、MCV、RDW、MCHC、HGB差异均不显著(P>0.05)。说明麻黄汤能略微增加冷应激小鼠红细胞指数。

表1 麻黄汤对冷应激小鼠红细胞数的影响

2.2.2 麻黄汤对冷应激小鼠白细胞指数及血小板的影响 由表2可知，与空白组相比，模型组和给药组的WBC数量极显著降低(P<0.01)，包括Lymp、Gran、Mono数量均极显著降低(P<0.01)，PLT值均有所升高(P>0.05)；与模型组比较，给药组的WBC值升高(P>0.05)，包括Lymp、Gran、Mono值均有所升高，但差异不显著(P>0.05)，PLT值略微降低(P>0.05)；比较各组的PLT值，差异不显著(P>0.05)。说明麻黄汤能增加冷应激小鼠白细胞指数，对血小板无显著影响。

表2 麻黄汤对冷应激小鼠白细胞及血小板数量的影响

2.3 麻黄汤对冷应激小鼠生化指标的影响

由表3可知，与空白组相比，模型组小鼠的urea含量显著升高(P<0.05)，给药组小鼠的urea降低(P>0.05)；与模型组比较，给药组小鼠的urea极显著降低(P<0.01)。与空白组相比，模型组和给药组小鼠的ALT水平均降低(P>0.05)；与模型组比较，给药组小鼠ALT水平升高，但差异不显著(P>0.05)。与空白组相比，模型组和给药组小鼠的AST升高，差异极显著(P<0.01)；与模型组比较，给药组小鼠的AST升高，差异不显著(P>0.05)。与空白组相比，模型组和给药组小鼠的Glu水平极显著升高(P<0.01)；与模型组比较，给药组小鼠的Glu水平极显著降低(P<0.01)。与空白组相比，模型组小鼠的CK活性极显著提升(P<0.01)，给药组小鼠的CK值降低，但差异并不显著(P>0.05)；与模型组比较，给药组小鼠CK值极显著降低(P<0.01)。说明麻黄汤能降低冷应激小鼠血清urea、Glu、CK水平。

表3 麻黄汤对冷应激小鼠生化指标的影响

2.4 麻黄汤对冷应激小鼠肝组织抗氧化指标的影响

由图1可知，与空白组相比，模型组中的MDA水平极显著升高(P<0.01)，给药组小鼠的MDA水平降低(P>0.05)；与模型组相比，给药组MDA值极显著降低(P<0.01)；说明麻黄汤能显著降低冷应激小鼠的肝脏MDA水平。由图2可知：与空白组相比，模型组的GSH水平降低，差异不显著(P>0.05)，给药组小鼠的GSH值升高(P>0.05)；与模型组相比，给药组GSH显著升高(P<0.05)；说明麻黄汤能提高冷应激小鼠肝脏的GSH水平。由图3可知：与空白组相比，模型组的SOD值降低，差异极显著(P<0.01)，给药组SOD值降低，差异不显著(P>0.05)；与模型组相比，给药组SOD升高，差异极显著(P<0.01)；说明麻黄汤能提高冷应激小鼠肝脏的SOD水平。

图1 麻黄汤对冷应激小鼠肝脏MDA水平的影响Fig.1 Effects of Mahuang decoction on MDA level of cold-stress mice liver (n =12)

图2 麻黄汤对冷应激小鼠肝脏GSH水平的影响Fig.2 Effects of Mahuang decoction on GSH level of cold-stress mice liver (n =12)

图3 麻黄汤对冷应激小鼠肝脏SOD活性的影响Fig.3 Effects of Mahuang decoction on SOD activity in cold-stress mice liver (n =12)

3 讨 论

动物在冷应激状态下，增加产热以维持体温恒定是动物机体重要生理机制之一[5]。研究表明，麻黄汤可通过减少散热、增加产热，以迅速升高体核温度调节机体代谢，还可作用于下丘脑的体温调节中枢使体温下降[16]。药理学研究表明，麻黄汤中的麻黄碱能兴奋中枢神经，对大脑、中脑及延脑、呼吸与循环中枢均起到兴奋作用，还有类似肾上腺素的作用，故内服麻黄制剂可使全身温暖，心跳加快，末梢血管收缩，血压升高，且作用和缓而持久；辅药桂枝含有桂枝醛能增强血液循环[17]。马江[18]通过计算机对麻黄汤口服生物利用度预测、类药性分析和靶点预测相结合，明确了麻黄汤中的活性化合物是通过舒张血管、促肾上腺素效应和促平滑肌收缩等作用发挥治疗伤寒证的功效；魏凤环等[19,20]研究发现，麻黄汤能使兴奋性氨基酸神经递质升高，增加小鼠自主活动的作用。本试验观察到，麻黄汤可以在一定程度上改善冷应激导致的小鼠精神状态、活动能力的抑制。

血液生理检查作为临床判断机体是否处于正常水平的基础的标准之一，对疾病的判断及预后具有重要意义。血液中RBC在机体中主要承担物质运输及部分免疫功能[5]。一般情况下，为维持体温恒定，冷应激时机体产热会增加，代谢的需氧量也相应增加，导致RBC增多及HGB升高。本研究中，经冷应激处理2 h后的小鼠RBC与HGB均高于空白组，而麻黄汤干预组小鼠RBC水平较模型组和正常组又有所提高，原因可能与麻黄汤能促进肝糖原分解、加快代谢，导致血液中的RBC代偿性升高以提供更多的氧气有关[21]。其中HCT增加，主要与RBC的数量增加相关。WBC主要包括Lymp、Gran、Mono等，在抵抗病原体的免疫应答中起重要作用，是临床上判断机体免疫力的重要指标之一[22]，冷应激时会发生显著变化。本试验结果显示，冷应激处理2 h后小鼠的WBC水平特别是淋巴细胞显著降低，这与Lavoy等[23]研究结果基本一致；而麻黄汤组小鼠WBC水平较模型组均有所增高，与喻敏等[24]研究结果一致。

血清生化指标常常反映动物机体的物质代谢水平和某些组织器官机能状态。AST广泛存在于肝脏、心肌、骨骼肌、肾脏及大脑内。本研究中，模型组小鼠AST水平上升，与穆淑琴等[28]的结果一致，是冷应激造成细胞受到不同程度损伤、通透性增加所致。麻黄汤组小鼠AST水平显著上升，可能与麻黄汤能调节糖代谢、花生四烯酸代谢及脂代谢等有关[29]。Glu是机体重要的能量来源，当动物暴露寒冷环境下，血液中Glu水平显著升高以增强产热维持体温[30]。CK是能量产生过程中一种重要的酶，主要存在于消耗能量迅速的组织和细胞中。研究显示，在麻黄汤的干预下，CK水平显著降低，提示其可缓解能量活跃细胞在冷应激状态下的损伤。urea是哺乳动物蛋白质代谢的产物，当机体肾功能出现异常或蛋白质代谢增强时会引起urea值增高。本试验中，模型组小鼠urea显著升高，与胡丽蓉[25]、黄立波等[26]的研究结果一致；而麻黄汤能缓解小鼠urea水平的升高，与赵莎[27]报道相吻合。其机制可能与麻黄汤降低了蛋白质代谢水平或提高代谢效率有关。

抗氧化是反映机体清除氧自由基降低细胞氧化损伤的能力，阻止损害生物细胞的一系列反应。MDA是脂质过氧化物反应中最重要的产物之一，能间接地反应细胞的损伤程度；GSH是机体清除氧自由基发挥抗氧化功能的重要物质，由自身的细胞合成；SOD广泛存在于任何细胞中，能清除氧自由基。急性冷应激状态下，动物肝组织中MDA水平显著升高[29]，GSH水平降低[32]，SOD水平显著降低[31-32]。本试验模型组小鼠肝组织MDA、GSH、SOD变化与上述研究结果一致，说明急性冷应激严重损害了小鼠的抗氧化能力。在麻黄汤的干预下，小鼠GSH、SOD水平显著升高，MDA水平显著降低，其中GSH水平升高与李星[33]研究结果一致，说明麻黄汤有效地保护了急性冷应激导致的小鼠氧化损伤。根据李睿[34]的研究，麻黄汤含有的各种生物碱、有机酸、挥发油、黄酮类等物质能有效保护线粒体，与机体的抗氧化应激密切相关；Moselhy等[35]发现桂枝酸能有效缓解四氯化碳造成小鼠的肝损伤降低氧化应激。

4 结 论

麻黄汤可以改善急性冷应激小鼠的精神状态和活动能力，增加应激状态下小鼠白细胞数量，显著降低肝、肾及心肌功能指标，从而缓解细胞损伤，增强肝脏的抗氧化功能。可见，麻黄汤能在一定程度上抵抗急性冷应激对小鼠造成的损伤。