辣椒烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的脱毒方法

曾祥亮，余冬冬，黄星锋，李永军

(1.龙港市信实庄稼医院，浙江 龙港 325800； 2.浙江农艺师学院，浙江 杭州 310021)

辣椒是中国五大蔬菜作物之一，有很高的营养价值、药用价值和经济价值。辣椒病毒病又称辣椒花叶病，是辣椒的主要病害之一，春、秋两季均有发生，严重影响辣椒的产量和质量。引起辣椒病毒病的病毒有多种，但主要为烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)。患病辣椒主要表现为花叶、黄化、矮化、坏死、畸形等症状，其中“三落”(落叶、落花、落果)现象最为严重。据不完全统计，每年因病毒病危害，辣椒可减产30%～50%。

已有研究发现，种子可携带病毒，辣椒烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的钝化温度在55 ℃以上，而辣椒种子温汤处理的耐温阈限在55 ℃以下，常规热处理无法钝化上述2种病毒。常规种子消毒法、化学处理法对辣椒烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的处理效果较差。

本试验采用茎尖培养结合热处理，旨在研究辣椒种子脱毒的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

试验辣椒品种为大果早丰。

1.2 方法

挑选粒大饱满的早丰1号辣椒种子浸泡6～8 h，用自来水冲洗1～2 h，75%的酒精处理2 min，无菌水冲洗2～3次，0.1%氯化汞消毒5～7 min，再用无菌水冲洗5～6次，播于1/2 MS无激素固体培养基。培养条件为光照∶黑暗14 h∶10 h，光照强度2 000 lux，白天温度(26±1)℃，夜晚温度(23±1)℃，待无菌苗出现2片以上真叶时，用汁液摩擦接种进行指示法病毒检测，无菌水处理的作为对照。

以MS为基本培养基，加入3%的蔗糖，0.7%的琼脂，pH 5.8～6.0，并在培养基中添加不同浓度的生长调节剂，建立适宜辣椒生长的离体培养技术体系[1]。取病毒检测为阳性的试材，待无菌苗有2～3片真叶时，切取其上端接种在上述培养基上进行继代增殖培养，分别采用辣椒的子叶、胚轴、真叶接种在上述培养基上进行诱导再生培养[2]。

经初代培养后，根据分化程度配不同的继代培养基以促茎、叶和根的生长或愈伤组织分化成苗。将培养获得的辣椒试管苗移栽到盛有消毒营养土的花盆中，上扣小烧杯，温室内培植数日后，移栽防虫网室,采用植物指示检测脱毒效果。

2 结果与分析

2.1 辣椒继代培养影响因素

以辣椒无毒苗切段(每节至少1个腋芽)为外殖体进行快速繁殖，找出适宜辣椒继代增殖的激素组分和培养条件。以MS培养基为基本培养基，在其中分别添加吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、奈乙酸(NAA)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA)等不同生长激素。

如表1所示，培养基中仅加生长素IAA、NAA，或添加高浓度的IAA，低浓度BA，易形成愈伤组织，但不能分化成苗，说明生长素在适宜浓度区间可以促进组织分化，但浓度过大时便会抑制根的发生。高浓度BA与低浓度IAA有利于诱导出芽，但伸长较慢，且生根也很慢，需将伸长的苗转到根诱导培养基中。

表1 培养基中添加NAA、IAA、BA对辣椒切断培养的影响

如表2所示，IBA浓度越高，越容易形成愈伤组织，同时也促进生根，GA的浓度越高，有利于促进芽的萌发。培养基中加入0.25 mg·L-1GA和0.1 mg·L-1IBA后，较适合辣椒的继代增殖，可一次成苗，成苗率高。

表2 培养基中添加GA、IBA对辣椒切断培养的影响

2.2 植物生长调节剂对辣椒子叶离体培养的影响

如表3所示，6-BA/IBA在11.25～12.5时器官分化率较高，6-BA/IBA在11.7～15时器官分化率较低。

表3 不同6-BA、IBA浓度对辣椒子叶器官分化的影响

2.3 植物生长调节剂对辣椒胚轴离体培养的影响

采用大果早丰辣椒品种的下胚轴，分别离体培养在附加不同种类和浓度的植物生长调节剂的MS培养基上，研究其对辣椒胚轴愈伤组织的诱导及再生情况[3]。试验结果显示，在培养基中添加5 mg·L-16-BA和0.8 mg·L-1IBA后，培养基对芽的诱导率较高(表4)。

表4 不同6-BA、IBA浓度对芽诱导的影响

2.4 热处理温度对脱毒效果的影响

如表5所示，随着处理温度的增加和处理时间的延长，处理植株的成活率逐步降低。当温度高于40 ℃时，植株均不能长时间存活；当温度低于38 ℃时，植株均能较好生长。在一定温度范围内，温度越高，病毒的钝化效果越好。在不影响辣椒存活的前提下，随着热处理温度的升高，植株的脱毒效果也就越好。实验结果表明，38 ℃的热处理4～6周时，辣椒脱毒效果最佳。

表5 不同处理温度对植株成活率的影响

3 讨论

由于辣椒外植体中不具有足够的内源激素，只有附加不同浓度的激素，才能促进辣椒外植体芽分化和芽伸长[4]。培养基中添加的激素种类、不同激素配比及其他生长因子对辣椒外植体分化和再生芽伸长影响较大。已有研究发现，培养基中添加4～6 mg·L-16-BA对辣椒外植体芽诱导效果最好[5]。本研究结果表明，较高的6-BA与IBA比值有利于不定芽的诱导和分化。影响辣椒再生植株的关键问题是分化的芽不能进一步伸长，大多只能见到一团叶片，由于选材及其他原因的影响，多数试验中植株再生频率低，不定芽生长能力差，有的甚至停留在芽诱导阶段，不能进一步生长，这主要与外植体的不同生理状态及培养基成分有关。随着处理温度的增加和处理时间的延长，处理植株的成活率逐步降低。38 ℃的热处理4～6周时，辣椒脱毒效果最佳。