气相串接质谱联用法确证人尿中44种外源性蛋白同化类激素

景晶 王杉 刘欣 杨声 邓静 张玉梅 杨志勇 张力思 张亦农

国家体育总局反兴奋剂中心（北京100029）

蛋白同化类固醇（anabolic androsgenic steroids）是一类能够促进肌肉和力量增长，加快训练后恢复的激素，因此常常被运动员使用来提高竞技能力，但长期使用会对运动员的身体造成伤害[1-3]，并且是对体育竞赛的公平公正原则的极大挑衅，1974 年国际奥委会规定体育运动中禁止使用该类物质[4]。

上世纪60 至70 年代采用放射免疫方法检测该类物质[5]，这种方法因为特异性差、适用范围局限等原因很快就被气相质谱法取代[5-6]。目前，世界反兴奋剂机构（World Anti-Doping Agency，WADA）对于蛋白同化激素检出能力的要求（Minimum Required Perfor⁃mance Levels，MRPL）一般在2～5 ng/ml，对检测能力提出了更高的要求。随着检测技术的发展，相对于单极质谱而言，气相串接质谱具有去干扰能力更强、灵敏度更高等优点，可以提高检测结果的准确性、科学性。目前，WADA 认可的实验室普遍采用气相串接质谱进行外源性蛋白同化类激素的初筛和确证[7]。

与初筛目的不同，WADA在技术文件TD2015IDCR[8]中规定了确证方法需要满足相对保留时间和离子丰度比的要求，对确证方法提出了更严谨的要求。尽管如此，WADA 并没有颁布统一的关于确证方法验证的标准。因此，本研究结合兴奋剂检测实际需求，建立一种适应常规检测、符合技术文件TD2015IDCR 要求的外源性蛋白同化类激素的确证方法。该方法涵盖WA⁃DA历年阳性检出率较高、WADA要求实验室必须检测出（符合技术要求）的44种外源性蛋白同化类激素，能更好地为兴奋剂检测工作提供科学、准确的保障。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

气相串接质谱（GC-MS/MS）:7693/7010Agilent Te⁃chonlogies；电热恒温水浴箱：HW1，北京医疗设备厂；离心机，Thermo fisher 公司；Vortex-2 涡旋混匀器：Sci⁃entific Industries 公司；氮吹仪：北京洼里医疗机械厂；电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；冷冻机，Xutemp公司；10 mL螺纹试管：Corning公司。

1.2 材料与试剂

44 种外源性蛋白同化类激素对照品溶液：澳大利亚计量院（NMI）；甲睾酮对照品：美国Sigma公司；氘代内标d4-雄酮-葡萄糖醛酸和d5-本胆烷醇酮（d4-An⁃drosterone-glucuronid acid，d5-Etiocholanlone）对照品：澳大利亚计量院（NMI）；β-葡萄糖醛酸苷酶E. Coli IXA 型：美国Sigma 公司；叔丁基甲醚：美国Dikma 公司；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）：美国Sigma 公司；碘化铵（NH4I）：北京J&Kchemical 公司；乙硫醇（Ethanethiol）美国Sigma 公司；0.2M 磷酸盐缓冲液、20%碳酸钠:碳酸氢钠（1∶1）缓冲液等试剂均为国产分析纯。

2 实验步骤

2.1 试剂与材料的制备

混合对照品工作液：将已稀释成100 ng·μL-1的对照品工作液从保干器中取出，用移液器分别量取44种对照品工作液（100 ng·μL-1）20 μL至10 mL螺纹试管中，55℃下氮气下吹干。加入甲醇定容至4 mL加盖混匀，配制成混合对照品工作液。

内标溶液：取出安瓿瓶恢复至室温，加入200 μL甲醇，分3次转移至1.5 mL螺口小瓶中，置于55℃下氮气下吹干。用移液器加入956 μL（说明书中质量为0.956 mg）甲醇定容后密封混匀，配制成浓度为1 mg·mL-1的d4-雄酮-葡萄糖醛酸对照品母液。如上所述分别配制浓度为1 mg·mL-1的d5-本胆烷醇酮和甲基睾酮对照品母液。

用移液器分别量取上述母液64、40、20 μL 至10 mL 螺纹试管，加入甲醇定容至5 mL，混匀密封置于4℃冰箱保存。根据尿样中内标d4-雄酮-葡萄糖醛酸/d5-本胆烷醇酮（结合/游离）判断样品酶解效率，确保葡萄糖结合型代谢产物酶解效果。

0.2 M 磷酸盐缓冲液：称取108 g 磷酸二氢钾和240 g 十二水合磷酸氢二钠，加入4000 mL 纯水，振摇至完全溶解，pH在6.0～7.0之间。

β-葡萄糖醛酸苷酶工作液：取适量β-葡萄糖醛酸苷酶冻干粉，倒入50 ml 离心管，然后加入0.2M磷酸缓冲液配制成浓度为50 units/μl的工作液，置于4℃冰箱中保存备用。

20%碳酸钠∶碳酸氢钠（1∶1）缓冲液：分别称取碳酸钠和碳酸氢钠各500 g，加入4000 mL 纯水，振摇至完全溶解，pH为9.0～10.0之间。

衍生化试剂：取适量MSTFA、NH4I 和Ethanethiol，配制成1000∶2∶6（w∶w∶v）的衍生化试剂。

2.2 样品前处理

所有受试尿样放置室温下，取2 mL 尿样置于10 mL 螺纹试管中，加入1 mL 磷酸盐缓冲液和50 μl β-葡萄糖醛酸苷酶工作液，涡旋器混匀，置于55℃恒温水浴中酶解2小时，取出。恢复至室温后加入20%碳酸钠︰碳酸氢钠（1︰1）缓冲液500 μl，然后加入4 mL叔丁基甲醚，加盖涡旋器混匀。将试管放入离心机3000 rpm/min离心3分钟，取出试管置于－30℃冰浴中，充分冷冻后取上清液至洁净试管中，置于55℃下氮气下吹干。加入50 μl 衍生化试剂，涡旋器混匀，用移液器转移至已在70℃电热干燥箱中干燥1小时的1.5 mL的进样小瓶中。加盖密封，于70 ℃下反应30 分钟后进样分析。

2.3 色谱质谱条件

色谱柱：HP-1 毛细管色谱柱（25 m×0.2 mm i.d.×0.11 μm）；载气：氦气，进样口温度：280℃；接口温度：300℃；采用恒压模式，柱压20 psi；分流比：10∶1；进样量2 μl；升温程序为：起始温度177℃，以3℃/min 速率升至245℃，然后以17℃/min 的速率升至320℃，保持2.5 min。

质谱离子源为EI 源，源温度为230℃，电子能量70 eV，采集模式为MRM。各化合物硅烷化衍生物的检测参数见表1。

3 结果与讨论

3.1 特异性和选择性

选择10份男女性别各半、比重分布在1.001～1.035之间、pH分布在5.5～9之间、不同色泽与浑浊度的空白尿样2mL，按照2.2的前处理方法进行处理，然后用2.3所述方法检测，确认10份尿样中在目标化合物出峰处无明显干扰，说明该方法选择性良好。在这些尿样中添加WADA要求的MRPL浓度下44种目标化和物。按照2.2 和2.3 所述方法进行检测。实验结果显示10 份样品中目标化合物的相对保留时间和离子丰度比均符合TD2015IDCR的要求，说明在MRPL浓度下该方法特异性良好。结果见表1。

表1 44种外源性蛋白同化激素的MRM参数

（续表1）

（续表1）

3.2 提取回收率

本验证实验在高（5倍MRPL）、中（MRPL）和低（1/2倍MRPL）三种浓度下进行。按照3.1所述原则选择10份空白尿样，每个浓度平行取2 份尿样，1 份在前处理之前加入上述3个浓度的待测目标化合物（峰面积用A表示），在萃取液中添加内标；1份在前处理之后的萃取液中加入上述3 个浓度的目标化合物（峰面积用B 表示）和内标；按照2.2 和2.3 所述方法进行检测。2 份样品的相对峰面积之比，即为回收率。按照下述公式进行计算：

实验结果显示，44 种外源性蛋白同化激素的提取回收率较好，能够满足常规检测的需要。

3.3 基质效应

按照3.1 所述原则选择10 份空白尿样，按照2.2 所述方法进行前处理，在获得提取液中加入MRPL 水平浓度的待测物质，吹干，衍生化上机进行检测得到峰面积A。另外，在上述方法衍生化步骤之前加入上述浓度的目标物质和内标，吹干，衍生化，上机检测得到峰面积B。基质效应可用下述公式计算：

基质效应=[ peak area（A）/ ISTD（A）] / [peak area（B）/ ISTD（B）]

从实验结果来看，尿样基质不会对检测造成显著影响。

3.4 稳定性

按照3.1 所述原则选择10 份空白尿样，在这些尿样中添加MRPL 浓度的44 种目标化合物。按照2.2 和2.3所述方法进行检测，10份样品中目标化合物的相对保留时间和离子丰度比均符合TD2015IDCR 的要求，分析完成后将小瓶重新密封置于－20℃冰柜保存，7天后再次检测，目标化合物能检出并且符合2015IDCR的要求，说明样品衍生化后在－20℃条件下密封保存，7天内稳定性良好。

3.5 携带污染

携带污染主要是体现样品之间的污染程度，对定量物质的检测结果会产生较大影响，一般要求携带污染的信号强度应低于最低定量限的20%。

取本方法验证中添加5 倍MRPL 浓度目标化合物的样品，同一序列中随行1个空白尿样作为阴性质控，未发现携带污染。

4 结论

采用气相色谱串接质谱联用技术建立了一种检测人尿中44 种外源性蛋白同化类激素的检测方法。经过方法验证，筛选出特异性和选择性良好的检测参数，能有效降低基质对待测物质的影响，稳定性良好。实验结果表明该方法可检测人尿中44 种外源性蛋白同化类激素。