不同产区枳壳指纹图谱采集方法研究

李丽蓉，颜干明，胡越，肖拯

（1.江西卫生职业学院，江西南昌 330052；2.江西古汉精制中药饮片有限公司，江西南昌 330000）

枳壳为芸香科柑橘属植物酸橙及其栽培品系的干燥未成熟果实，枳壳是江西省的道地药材，但在湖南、四川、浙江、山西和贵州等地均有栽培。枳壳含有黄酮类、生物碱类、挥发油类以及香豆素类等有效成分，具有理气宽中、行滞消胀的功效[1-2]。目前，有部分枳壳指纹图谱的相关研究报导[3-9]，但通过指纹图谱技术进行江枳壳（江西产区的枳壳）与非道地药材鉴别尚无明确参考依据。本文将不同产地枳壳药材进行HPLC指纹图谱表征和比较，运用聚类分析和指纹图谱软件进行数据分析，旨在为枳壳的道地性鉴别和质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20高效液相色谱仪，岛津仪器（苏州）有限公司；UV756紫外分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；AUW120D十万分之一电子天平，岛津仪器（苏州）有限公司；HC-150T2型高速多功能粉碎机，永康市绿可食品机械有限公司；FST-JY普利菲尔超纯水机，济南佰源医疗设备有限公司；KQ3200B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

柚皮苷对照品，批号110831-201204，浙江永健医药有限公司，纯度≥90%；新橙皮苷，批号23094-69-1，浙江永健医药有限公司，纯度≥98%；川陈皮素，批号476-66-4，浙江永健医药有限公司，纯度≥98%；橘皮素，批号476-66-4，浙江永健医药有限公司，纯度≥98%；甲醇，色谱纯，天津市永大化学试剂厂；磷酸，分析纯，上海笛柏化学试剂厂；水为超纯水。

1.2 试验药材

采集16个产地的枳壳药材样品，药材信息如表1所示。经江西古汉精制中药饮片有限公司颜干明执业中药师鉴定，所有样品均为芸香科植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实。

表1 不同产地枳壳药材样品信息

1.3 试验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

取各枳壳药材粉末0.2 g，加入甲醇溶液30 mL，超声提取30 min，经0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.3.2 对照品溶液的制备

分别取柚皮苷、新陈皮苷、川陈皮素和橘皮素对照品2.31 mg、2.32 mg、0.92 mg和0.96 mg，用甲醇溶解于10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

1.3.3 色谱条件

采用Eclipse Plus-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行检测，流动相为甲醇（A）和pH为4.5的磷酸水溶液（B），柱温30 ℃，检测波长320 nm。洗脱程序为：0～20 min，30%～50%（A）；20～35 min，50%～70%（A）；35～50 min，70%～80%（A）；50～60 min，80%～100%（A）。改变检测波长和流动相，比较不同条件下的出峰情况，优选出最佳色谱条件。

1.3.4 枳壳药材指纹图谱的采集

按“1.3.1”项下方法制备各供试品溶液，在“1.3.3”选定的色谱条件下进样分析，记录色谱图并积分，同时标定了8个共有峰。通过LC solution输出药材的色谱图。

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度试验

按“1.3.1”项下方法制备同一枳壳供试品溶液，在“1.3.3”的选定色谱条件下连续进样6次，选择保留时间18.789 min的色谱峰为参照峰，计算得到HPLC色谱图中所有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%。

1.4.2 稳定性试验

按“1.3.1”项下方法制备同一枳壳供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h测定，选择保留时间18.789 min的色谱峰为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于3%，供试品溶液在24 h内稳定。

1.4.3 重复性试验

精密称定6份枳壳药材0.2 g，按“1.3.1”项下方法制备供试品溶液进样分析，选择保留时间18.789 min的色谱峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间和相对保留峰面积的RSD值均小于3%。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

基于文献研究[6-9]比较了254 nm、283 nm、300 nm、320 nm、330 nm 5个波长，结果显示，320 nm波长下色谱峰的数量较多，分离度较好，故选择320 nm作为枳壳检测波长；分别考察了甲醇-水，甲醇-磷酸水，乙腈-水，乙腈-磷酸水体系，根据色谱图发现，用甲醇-水和乙腈-水体系时色谱图拖尾较严重，故考虑甲醇-磷酸水和乙腈-磷酸水体系，乙腈-磷酸水体系和甲醇-磷酸水体系峰型相似，考虑经济性，故选择甲醇-磷酸水体系。通过对甲醇-磷酸水pH值比较峰型及结合柱子的适应性，最终选用甲醇-磷酸水（pH=4.5）体系为流动相。

2.2 枳壳药材的指纹图谱相似度评价

运用国家药典委员会制定的《中国色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》分析数据并对相关参数进行自动匹配，结合对照指纹图谱（图1），计算各产地枳壳药材提取物指纹图谱的相似度。不同产地指纹图谱叠加图见图2。如表2所示，为16批枳壳指纹图谱相似度结果。浙、川和江西产地指纹图谱相似度均大于0.85，表明各产地药材之间具有较好的一致性，而16批次枳壳相似度计算显示相似度较差，其中S13（采集地点为越南一带）相似度最低。

图1 枳壳对照指纹图谱

2.3 聚类分析

利用SPSS 19.0数据分析软件进行系统聚类分析，因S13～S16 4个产区枳壳指纹图谱与其他12个产区的指纹图谱差异较大，故进行剔除处理。将浙、川和江西产地枳壳药材特征峰的相对峰面积标准化后采用组间联接法，利用欧式距离度量标准对样品进行聚类，结果见图3。枳壳药材可大致分为3大类，其中S4、S5聚为一类，S6、S7、S8、S10聚为一类，S1、S2、S3、S9、S11和S12聚为一类。聚类分析显示产地及采集时间会影响枳壳药材的质量。

图2 16批枳壳高效液相指纹图谱

表2 16批枳壳指纹图谱相似度结果表

图3 不同产地枳壳聚类图

3 结论

从中药指纹图谱的角度分析16批枳壳，发现10批江西枳壳的指纹图谱相似度极高，浙、川枳壳与江西枳壳指纹图谱相识度较高，但越南一带、湖南省益阳市、陕西省汉中市及皖南一带与江西枳壳指纹图谱存在较大差异，说明地域对枳壳药材的质量影响较大，其中以3号峰峰面积差异最大，后续将继续收集其他产地药材，以期为枳壳更好的开发利用提供资料。