复配溶菌酶和甘草提取物的抑菌牙膏研究

徐天生，褚夫江，耿帅峰，欧阳学琭，李婷

（1.好易康生物科技（广州）有限公司，广东广州 510700；2.广东药科大学，广东广州 510006）

口腔问题主要是由细菌引起的，采用有效的牙膏和漱口液可以明显降低口腔内致病菌的数量，改善甚至消除口腔疾病。牙膏等口腔护理产品之所以能实现这些功能主要是依靠产品中的活性成分或抑菌成分，这些抑菌成分多为化学类抑菌剂，如三氯生、西吡氯铵、洗必泰、抗生素等，经常使用含有这些成分的口腔护理产品容易造成口腔细菌生态失调，或使细菌产生抗药性，不能达到预防口腔疾病的效果，反而引发其他多种口腔疾病。

溶菌酶（Lysozyme）是唾液中的一种非特异性物质成分，可以抑制微生物生长，与抗生素或其他抑菌物质对比，长期使用溶菌酶不易出现抗药性[1]。溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸（NAM）的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的4位碳原子间的β-1.4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，由NAM、NAG和肽“尾”（一般是4个氨基酸）组成，NAM与NAG通过β-1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”（肽键或少数几个氨基酸）连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤[2]。对于革兰氏阳性菌（G+），如金黄色葡萄球菌、枯草杆菌或溶壁微球菌等，与革兰氏阴性菌（G-），如大肠杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、肺炎杆菌等，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对G+细菌有很好的抑杀效果，但是对G-细菌的作用就比较弱[3]。

本研究针对目前存在的问题，着力从复配溶菌酶和甘草提取物的角度，去完善单一功能物质的不足，并将溶菌酶和甘草提取物的复合物应用在牙膏中，从而形成一系列更符合市场需求的抑菌牙膏产品。

1 材料与方法

1.1 材料

溶菌酶样品为好易康公司实验室提供，甘草提取物为符合要求的市售优级品；变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌由广东省微生物研究所提供；涉及的试剂均为分析纯。

1.2 溶液配制

1.2.1 溶菌酶水溶液的制备

准确称量0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g溶菌酶样品，分别溶于50 mL水中，最后定容至100 mL，分别得0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%含量的溶菌酶水溶液。

1.2.2 甘草提取物水溶液的制备

准确称量0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g和0.5 g甘草提取物样品，分别溶于50 mL水中，最后定容至100 mL，分别得0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%含量的甘草提取物水溶液。

1.3 抑菌效果检测方法

按照QB 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》中7.3作为检测依据，以对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制率为考察指标，对物质的抑菌效果进行评价。具体操作方法如下：

（1）用PBS（0.03 mol/L磷酸盐缓冲液）液将变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌稀释成浓度为1×104～9×104cfu/mL；（2）将试验样品用无菌标准硬水稀释至合适低浓度；（3）吸取试验样品原液5.0 mL放入灭菌试管中，20 ℃恒温5 min；（4）吸取试验菌液0.1 mL加入到含5.0 mL样品的试管中，迅速混匀，并立即计时；（5）作用3 min后，取试验菌与样品混合液0.5 mL，加入到含4.5 mL经灭菌的PBS试管中，充分混匀；（6）放置10 min后，吸取样液1 mL，置于灭菌平皿内，每个样液接种两个灭菌平皿，用凉至40～45 ℃的营养琼脂培养基15 mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，（35±2）℃培养48 h后，做活菌菌落计数；（7）以PBS替代试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品；（8）实验重复3次，求其平均值。计算公式如式1所示。式中，α为对照样品平均菌落数，β为试验样品平均菌落数，结果保留整数。

1.4 抑菌效果测定

1.4.1 溶菌酶水溶液

将以上制得的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%溶菌酶水溶液共计5个样品按照1.3方法，对变异链球菌（G-）、牙龈卟啉单胞菌（G-）、金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G+）4种口腔致病菌进行抑菌检测。

1.4.2 甘草提取物水溶液

将以上制得的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%甘草提取物水溶液共计5个样品按照1.3方法，对变异链球菌（G-）、牙龈卟啉单胞菌（G-）、金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G+）4种口腔致病菌进行抑菌检测。

1.4.3 溶菌酶复配甘草提取物

在不增加抑菌物用量的前提下，即控制抑菌物质的总量为0.3%，测试溶菌酶和甘草提取物在复配比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1和4∶1的抑菌效果，从而优选最佳的复配比例。

1.5 溶菌酶和甘草提取物复配物在牙膏用的应用

选定目前比较主流的氢氧化铝、碳酸钙、二氧化硅、磷酸氢钙4种配方体系作为验证配方，为了尽量避免其他原料的影响，配方中不添加任何其他的功能剂，同时不添加任何防腐剂。配方设计见表1。

表1 配方设计 单位：%

2 结果与分析

2.1 溶菌酶水溶液的抑菌效果测定。

图1为不同浓度溶菌酶的抑菌效果，随着溶菌酶水溶液浓度的上升，样品抑菌率也随之上升，但当浓度上升至0.3%后，抑菌能力提高有限，与浓度为0.4%、0.5%的样品抑菌效果差别不大；同时还可以看出，溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较革兰氏阴性菌好。

图1 不同浓度溶菌酶抑菌效果

2.2 甘草提取物水溶液的抑菌效果测定

图2为不同浓度甘草提取物抑菌效果，可以看出，甘草提取物有一定的广谱抑菌能力，随着浓度的上升，抑菌能力也随之上升，当浓度上升至0.3%后，抑菌能力达到提高有限，与浓度为0.4%、0.5%的样品抑菌率基本一致。

图2 不同浓度甘草提取物抑菌效果

2.3 溶菌酶复配甘草提取物的抑菌效果

从2.1可以得出，0.3%溶菌酶已有较好的综合抑菌能力，但由于抑菌机理的原因，对革兰氏阳性菌的抑菌能力较革兰氏阴性菌的抑菌能力要强；而从2.2可以得出，甘草提取物具有较好广谱的抑菌能力，且达到0.3%浓度时，就有较为理想的广谱抑菌能力。

将溶菌酶和甘草提取物按比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1和4∶1的共计7个复配物对4种口腔致病菌病进行抑菌检测，结果见图3。

从图3可以看出，溶菌酶和甘草提取物的最佳复配比例为3∶1，即0.225%的溶菌酶复配0.075%的甘草提取物有最佳的抑菌能力，这个复配组合较好地起到了协同增效的能力，使得复配物的广谱抑菌能力得到较大的提升，同时改善了溶菌酶对革兰氏阳性菌抑菌的能力强于革兰氏阴性菌的现象。

图3 不同比例的溶菌酶和甘草提取物复配物的抑菌效果

2.4 4种配方体系的抑菌效果测定

4个配方体系的牙膏对4种口腔致病菌的抑菌检测结果见图4。从图中可以看出，在牙膏中添加0.225%的溶菌酶复配0.075%的甘草提取物（比例为3∶1）后，不含任何功能剂和防腐剂的4种牙膏配方体系都延续了复配物原有的良好抑菌性能。

图4 不同配方体系牙膏的抑菌效果

3 结论

溶菌酶和甘草提取物均有较好的抑菌能力，其中溶菌酶的抑菌能力好于甘草提取物；溶菌酶对革兰氏阴性菌的抑菌能力弱于革兰氏阳性菌，而甘草提取物对两种菌的抑菌能力差异较小；研究溶菌酶与甘草提取物复配，在总添加量为0.3%下，溶菌酶、甘草提取物比例为3∶1时，复配物的抑菌能力最强，在控制总量不增加的前提下，达到了溶菌酶和甘草提取物协同增强的效果，且该比例的复配物应用在不含任何功能剂和防腐剂的4种体系牙膏配方中，膏体的抑菌能力与复配物基本一致，有良好的抑菌能力。