苞叶雪莲中活性成分对EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用

叶 萍，李海丽,3*，林鹏程,3，许地元

(1.青海民族大学药学院，青海西宁 810007；2.青藏高原植物化学重点实验室，青海西宁 810007；3.青海省药物分析重点实验室，青海西宁 810007)

苞叶雪莲（Saussurea obvallata）为凤毛菊属雪莲亚属植物，别称“苞叶凤毛菊”，是高原地区特有的一种植物，性温、微苦,能清热解毒、祛风除湿、通经活血，藏医用于治疗瘫痪、癫痫、麻风病、疮疖疔毒等[1-2]。我们在前期研究中发现苞叶雪莲的粗提物对Na2S2O4造成的EA.hy926 细胞缺氧损伤具有保护作用[3]，但苞叶雪莲中具体功效成分尚未明确。因此我们进行了进一步研究，发现苞叶雪莲的抗缺氧活性部位是乙酸乙酯相中氯仿∶甲醇梯度洗脱比例中的10∶1 这一洗脱组分。我们将乙酸乙酯相的10∶1 组分再进行分离，将分离得到的单体化合物芦丁、槲皮素继续在细胞水平上进行抗缺氧活性实验，探究其单体的抗缺氧活性，结果表明芦丁、槲皮素为苞叶雪莲抗缺氧作用的主要活性成分。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

倒置荧光显微镜（日本尼康公司），96 孔板（Corning 公司），十万分之一电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司），CO2培养箱（三洋公司），超净工作台（东联哈尔公司），Multiskan Spectrum 酶标仪（美国Thermo Scientific 公司）。

1.2 试剂

连二亚硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；生理盐水（国药集团化学试剂有限公司）；培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶、P/S（抗生素）均购买于Gibco 公司；DMSO（Sigma 公司）；CCK-8（Biosharp 公司）；98%浓硫酸、95%乙醇、甲醇、氯仿、石油醚和乙酸乙酯（分析纯）均购自于天津市红岩化学试剂厂；大孔吸附树脂AB-8（南开大学化工厂）；葡聚糖凝胶LH-20（pharmacia）。EA.hy926细胞株购自上海细胞所。

苞叶雪莲为2019年8月采于青海互助北山，经青海民族大学林鹏程教授鉴定为凤毛菊属雪莲亚属植物。经提取分离得到芦丁、槲皮素单体化合物，实验中用蒸馏水溶解稀释为浓度分别为0.100 00、0.050 00、0.025 00、0.012 50 和0.006 25 mg/mL 的供试药物。

2 实验方法与结果

2.1 苞叶雪莲有效部位的提取分离

将苞叶雪莲粗提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水相萃取物，分别浓缩，经活性初步筛选，发现乙酸乙酯部位具有活性，确定对乙酸乙酯部位进行分离纯化。将浸膏用有机溶剂全部溶解，与100～200目的柱层析硅胶全部搅拌均匀，晾干后按体积比1(样品)∶5(硅胶)装柱并干法上样。以氯仿-甲醇体系为洗脱体系，依次用氯仿∶甲醇体积比为100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、纯甲醇梯度洗脱，洗脱液经分析合并，减压浓缩分别得到7 个馏分，经活性筛选后发现活性部位为乙酸乙酯相的10∶1部位，以5∶1 的石油醚-丙酮体系洗脱得2 个组分∶Fr1 和Fr2，Fr2 经HPLC(30%甲醇-水)制备液相色谱分离乙酸乙酯相得化合物1和化合物2。经结构鉴定，化合物1为芦丁，化合物2为槲皮素，共分离得到芦丁5.6 mg，槲皮素11.2 mg。

2.2 细胞培养

取出冻存在液氮罐中的EA.hy926内皮细胞，复苏。取适量细胞于T25 培养瓶中，加入4 mL 培养液，轻轻晃动培养瓶，使细胞混匀。将培养瓶置于培养箱中（37℃，5%CO2湿度饱和），24 h 后更换培养液，再过48 h 后观察细胞形态，若适合传代，则将细胞传代，并接种在96 孔板中。传代的细胞继续培养或冻存，留待后续实验使用[4]。

2.3 缺氧模型的建立

将EA.hy926 细胞接种于96 孔板中，调整细胞浓度至10 000/孔左右，每孔100 μL，放入培养箱培养24 h 后取出并观察细胞形态。设立阴性对照组、缺氧组及给药组，阴性对照组每孔加入10 μL 生理盐水，缺氧组每孔加入100 mmol的Na2S2O410 μL（Na2S2O4的终浓度为8 mmol），给药组每孔加入100 mmol的Na2S2O410 μL 及10 μL 不同浓度的单体化合物（芦丁、槲皮素首浓度均为0.1 g/L，2 倍稀释后得到下一浓度），放入培养箱中培养24 h，倒置显微镜下观察细胞形态在给药前后的变化并拍照记录。培养结束后每孔加入10 μL CCK-8，于培养箱中孵育30 min，在450 nm波长下观察OD值[5-6]。

正常培养的EA.hy926 细胞为贴壁细胞，呈梭形，如图1 所示。缺氧的EA.hy926 细胞受损，细胞边缘模糊不清，细胞不再贴壁，呈畸形，细胞圆缩，大量死亡，部分死亡的EA.hy926细胞漂浮于培养基中，如图2所示。芦丁和槲皮素给药组对EA.hy926细胞的缺氧环境有明显改善，细胞存活较多，细胞形态良好，结果见图3、4。

图1 EA.hy926细胞正常形态观察（×40）

图2 EA.hy926细胞缺氧形态观察（×40）

图3 芦丁给药EA.hy926细胞形态观察（×40）

2.4 CCK-8法检测提取物对缺氧EA.hy926细胞的活性

图4 槲皮素给药EA.hy926细胞形态观察（×40）

运用CCK-8 法检测不同浓度芦丁和槲皮素对缺氧EA.hy926 细胞的活性影响，在酶标仪450 nm波长下读取OD 值，计算细胞存活率。通过数据分析可知，芦丁、槲皮素具有较好的抗缺氧活性，结果如图5～6。

图5 芦丁给药细胞存活率

3 讨论

本文主要针对苞叶雪莲抗缺氧活性进行研究，通过细胞实验对苞叶雪莲的抗缺氧活性成分进行追踪，最终确定其活性部位是粗提物的乙酸乙酯相中氯仿∶甲醇比例为10∶1时洗脱下来的组分，并从该组分中分离鉴定出芦丁和槲皮素。通过细胞实验分别对芦丁、槲皮素单体化合物进行抗缺氧实验，发现芦丁、槲皮素具有较好的抗缺氧活性，与姚娟[7]、杨溢[8]和王赟[9]的研究成果一致。

图6 槲皮素给药细胞存活率

苞叶雪莲粗提物中含有丰富的黄酮类化合物[10]。这些物质能够调节造血系统功能、增强血液的携氧能力[11]，保护心血管系统、提高缺氧时静脉内皮细胞的活性[12]，提高机体抗氧化和清除自由基的能力，因此对缺氧引起的机体氧化损伤具有保护作用[13]。本实验在一定程度上证明了文献记载中苞叶雪莲通经活血的功效。