响应面法优化超声辅助提取金线莲总黄酮工艺研究*

汤须崇，刘希敏，卢绍基，邓爱华，牛文静

(1 华侨大学化工学院，福建 厦门 361021；2 厦门塔斯曼生物工程有限公司，福建 厦门 361027；3 湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000)

金线莲(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl)属于兰科开唇兰属植物，又名金线绒、金石松、金线草、鸟人参、金蚕等，是我国一种珍贵的传统中药材，以全草入药，味甘、性平[1-2]。药理研究发现，金线莲具有多种药理活性可用于高血压、糖尿病、心脏病、肾炎、肿瘤等的治疗[3]。金线莲富含黄酮类化合物、多糖、生物碱、挥发油、甾体化合物、氨基酸等多种植物活性成分[4]。金线莲临床药理价值是基于其中主要活性物质多糖类、黄酮类及黄酮苷元，同时黄酮类和多糖类化合物也是检测天然产物活性成分的重要指标[5]。黄酮类化合物又称黄酮体、类黄酮等，目前金线莲中已被发现的黄酮类有30多种，主要以槲皮素、山奈酚、异鼠李糖及其衍生物为主[6-7]。金线莲总黄酮具有多种药理作用，具有降血糖、降血压、抗氧化、保肝、抗炎症和镇痛等的药用功效。李明等[8]发现黄酮类化合物可改善肠道菌群治疗炎症肠病；白鹭等[9]研究发现黄酮类可通过抗炎等作用对血管内皮细胞损伤起保护作用；李鸿等[10]实验发现该类化合物可起到抗动脉硬化作用；王虹等[11]发现黄酮类化合物能起到调节免疫信号通路治疗相关免疫疾病的作用；研究还显示黄酮类还具有抗乳腺癌[12]，抗肝癌[13]，抗肺癌[14]等作用。近年来金线莲的研究主要集中在药理活性及多糖提取与应用，而有关金线莲总黄酮的研究相对较少但其又具有巨大的利用价值，值得对其提取工艺进行优化，提高金线莲中总黄酮得率，为金线莲中总黄酮深入研究提供前提条件。

目前金线莲总黄酮的提取方法主要有：醇提、水提、碱提、系统溶剂提取以及超声波、微波、酶、超临界萃取等[15-22]。超声波提取是以溶液为介质发出一定频率的超声波产生空化作用和机械效应，这种作用可使待提取中药材细胞壁被破坏，提取物溶出到提取液中。超声条件温和不会破坏有效成分结构，且操作简便，能耗低提取效率高[23]。本研究采用超声波辅助溶剂法提取技术，运用Box-Behnken中心组合设计以提取温度、超声时间、料液比以及乙醇浓度为影响因素的四因素三水平实验模型，建立回归方程，以响应面分析法(RSM)[24]对试验结果进行分析，对金线莲总黄酮的提取工艺进行优化，为进一步研究其药理活性、作用机制提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金线莲，厦门塔斯曼生物工程有限公司；芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；氢氧化钠，上海国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠，上海国药集团化学试剂有限公司；硝酸铝，上海国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，上海国药集团化学试剂有限公司。其余试剂均为药用级。

1.2 仪器与设备

600Y老本行多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；DHG-9075A鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；AR1502CN电子分析天平，上海奥豪斯仪器有限公司；KQ5200E超声波清洗仪(功率300 W)，昆山市超声仪器有限公司；UV-8000紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；Hei-VAP Precision旋转蒸发仪，德国海道夫公司；DK-S22电热恒温水浴锅，上海精宏仪器有限公司；SHB-IIIT循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

2 方 法

2.1 金线莲总黄酮的提取工艺

称取5 g的金线莲干燥样品，加入一定量的乙醇溶液，在一定的温度和功率超声处理一定时间，过滤，续滤液测定其总黄酮含量。

2.2 总黄酮含量的测定[25]

2.2.1 标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重的芦丁标准品5.0 mg，用60%乙醇配置成0.1 mg/mL芦丁标准溶液。精密移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL芦丁标准溶液置于10 mL容量瓶中，加入2 mL 60%乙醇溶液再加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，静置6 min；加入1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，用60%乙醇定容至10.0 mL，静置15 min。以芦丁含量(mg/g)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制芦丁标准曲线如图1所示，得到回归方程为Y=1.4729X+0.0033(R2=0.9989)。

图1 芦丁含量标准曲线

2.2.2 金线莲黄酮得率的计算

准确吸取1.0 mL待测样品于10 mL比色管中，加入60%乙醇溶液2 mL，再加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，静置6 min；加入1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，用60%乙醇定至10.0 mL，静置15 min，以不加芦丁标准品的溶液作为空白对照，于510 nm处测定其吸光度。按下式计算样品中总黄酮的提取量：

总黄酮提取量=CD/m

式中，C为回归计算得到的总黄酮含量，mg/mL；D为稀释倍数；m为称取金线莲样品的质量，g。

2.3 单因素实验

根据文献报道和预实验结果，分别考察温度、超声时间、料液比以及乙醇浓度等4个单因素对金线莲总黄酮提取量的影响。

2.3.1 温度对总黄酮提取量的影响

称取干燥金线莲样品，加入体积分数为70%的乙醇溶液，料液比为(g∶mL)1∶40，超声时间50 min，分别于温度20、30、40、50、60、70 ℃进行超声提取，测定提取液中总黄酮提取量。

2.3.2 超声时间对总黄酮提取量的影响

称取干燥金线莲样品，加入体积分数为70%的乙醇溶液，料液比为(g∶mL)1∶40，温度设定50 ℃，分别提取20、40、60、80、100、120 min，测定提取液中总黄酮提取量。

2.3.3 料液比对总黄酮提取量的影响

称取干燥金线莲样品，加入体积分数为70%的乙醇溶液，温度设定50 ℃，超声时间50 min，分别以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45进行超声提取，测定提取液中总黄酮提取量。

2.3.4 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

称取干燥金线莲样品，料液比为(g∶mL)1∶40，温度设定50 ℃，超声时间50 min，分别以乙醇浓度0、20%、40%、60%、80%、95%进行超声提取，测定提取液中总黄酮提取量。

2.4 响应面试验设计

按照Box-Behnken 试验设计原理，在根据单因素考察实验选取温度(A/℃)、超声时间(B/min)、料液比(C/g:mL)和乙醇浓度(D/%)为因素，金线莲中总黄酮提取率为响应值(Y)，设计四因素三水平的响应面试验。实验设计水平表见表1。

表1 实验设计水平表

2.5 验证实验

称取金线莲药材3份，按照最佳工艺条件进行提取，按照“2.1项金线莲总黄酮的提取工艺”，按“2.2总黄酮含量测定”项测定金线莲总黄酮提取率。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

3.1.1 温度对总黄酮提取量的影响

超声波提取温度对金线莲总黄酮提取效果的影响见图2。由图2可知，温度对金线莲总黄酮的提取量具有一定的影响，在20～60 ℃随着温度的增加逐渐增加，当温度为60 ℃时总黄酮提取量最高；当提取温度升至70 ℃时，总黄酮提取量呈下降趋势，这可能是由于温度超过60 ℃会引起乙醇溶剂的蒸发，降低了乙醇溶剂的浓度，导致总黄酮溶出量下降。因此，提取温度最好控制在60 ℃。

图2 温度变化对总黄酮提取的影响

3.1.2 超声时间对总黄酮提取量的影响

超声时间对金线莲总黄酮提取效果的影响见图3。图3显示，超声时间较短时，总黄酮提取量较小，可能时间较短不利于金线莲总黄酮的提取。随着超声时间的增加其提取量逐渐增加，超声波的空化作用加速了金线莲细胞内总黄酮的溶出，当超声时间为80 min时总黄酮提取量最高，之后就有下降的趋势，可能是超声时间过长导致金线莲中其他成分的溶出，从而降低了总黄酮溶出的比例。又因为总黄酮提取量变化不大，选择40，50，60 min来进行响应面优化考察。

图3 超声时间变化对总黄酮提取的影响

3.1.3 料液比对总黄酮提取量的影响

超声提取料液比对金线莲总黄酮提取效果的影响见图4。由图4可知，总黄酮的提取量随着料液比的增加而逐渐上升到趋于平稳。料液比为1∶35，1∶40，1∶45时，从图4看到总黄酮提取量有微弱增加但相差不大，基本已趋于平稳。在保证总黄酮提取量的基础上，考虑到节约溶剂的用量及成本问题，选择1∶40为考察最佳料液比。

图4 料液比变化对总黄酮提取的影响

3.1.4 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

超声提取乙醇浓度对金线莲总黄酮提取效果的影响见图5。由图5可知，金线莲总黄酮提取量随着乙醇体积分数的增加而升高，当乙醇浓度为80%时，对总黄酮的提取效果最好，乙醇浓度提升至95%时，总黄酮提取量反而减少。其原因可能为总黄酮包括黄酮及其苷类化合物，在乙醇浓度较低时，表现出水的极性，具有羟基的苷类化合物先溶出；随着乙醇浓度逐渐提高，极性降低，疏水性的逐渐溶出；乙醇体积分数过高，会增加相关杂质溶出降低了总黄酮提取率。因此，选择乙醇的体积分数为80%最佳。

图5 乙醇浓度变化对总黄酮提取的影响

3.2 响应面实验结果

响应面法实验设计方案与结果见表2。

表2 响应面分析方案及试验结果

对表2中金线莲总黄酮提取量(Y)及四个影响因素进行二次回归模型拟合，其结果见表3可知。

表3 响应面分析法方差分析

对表3实验数据进行多元回归拟合，得到的二元多项回归方程为：

R=5.84-0.078A+0.15B+0.15C+0.59D+0.056AB+0.25AC-0.089AD-0.49BC-0.23BD-0.44CD-0.37A2-0.25B2-0.33C2-0.41D2

由表3分析结果看，整体模型的P<0.01，表明该二次方程模型极显著。而且方程的失拟项不显著(P>0.05)，说明非试验因素对试验结果的影响不大，可用于金线莲总黄酮提取实验预测。因素D，BC，CD，A2，D2为显著影响因素。两两因素之间的交互作用中，超声时间和料液比的交互作用、料液比和乙醇浓度的交互作用对金线莲黄酮提取效果影响显著。

由结果可知，模型的相关系数R2=0.9325，说明因变量和自变量之间线性关系显著且拟合度较好实验误差影响较小。说明应用响应面法优化的金线莲总黄酮提取工艺准确可靠。

金线莲总黄酮提取的等高线图与响应面3D图见图6。直观地看交互作用的响应面曲线图就能发现各因素对响应值的影响。在响应面曲线图中交互作用影响总黄酮提取率的显著性与响应面的坡度相关，曲面图中若曲面坡度陡峭则因素发生较小变化时总黄酮提取率数值就会改变较大，那么两个因素结合在一起对实验结果影响较大。图6(i)中，控制AD两因素不变，B超声时间与C料液比交互作用导致曲面坡度陡峭即总黄酮提取率变化较大。

图6 金线莲总黄酮提取响应面分析等高线(a,c,e,h,j,l)及响应面(b,d,f,i,k,m)

3.3 最佳提取工艺

根据Expert 8.0.6 软件分析结果，金线莲黄酮的最佳提取工艺为：提取温度45.01 ℃，超声时间57.77 min，料液比为1∶30，乙醇浓度为80%，此条件下金线莲黄酮提取率预测值为6.25 mg/g。

3.4 验证实验

为确保该工艺的稳定性与合理性，根据响应面法得出的最佳提取工艺条件进行三组验证实验，按照2.1项方法制备供试品溶液，测定金线莲总黄酮含量。为方便实验具体操作，将提取温度设定为45 ℃，超声超声时间58 min，料液比为1∶30，乙醇浓度为80%。实际测得金线莲黄酮平均提取量为6.20 mg/g，与理论预测值6.25 mg/g相比无显著性差异(P<0.01)。因此，采用Box-Benhnken的中心组合试验设计优化的金线莲黄酮提取工艺条件稳定可行，准确可靠。

表4 验证实验结果

4 结 论

本研究采用响应面法(Design-Expert软件)[26]考察金线莲中黄酮的提取工艺，并且根据二次方程模型分别做出了试验因素间交互作用的三维立体响应曲面和等高线图。结果显示，二次方程的模拟回归差异显著，表明实验建立模拟回归方程能较好地反映影响因素与响应值之间的关系，实验设计可靠。

本实验首先通过单因素试验分析不同因素对金线莲总黄酮提取量的影响，确定了合适的提取条件；再根据 Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，以金线莲总黄酮提取量为响应值，温度(A/℃)、超声时间(B/min)、料液比(C/g∶mL)和乙醇浓度(D/%)为影响因素设计的响应面分析实验。通过对响应值结果分析，获得金线莲总黄酮最佳提取工艺为：提取温度 45 ℃，超声超声时间58 min，料液比为1∶30，乙醇浓度为80%。通过验证实验，与模型预测值基本相符，证明了该工艺的可行性。该提取工艺可为金线莲总黄酮的进一步开发利用研究提供科学依据，具有良好的应用前景。