毛细管电泳技术在疾病预防控制领域的应用、发展与挑战

林长缨, 丁晓静

(北京市疾病预防控制中心, 食物中毒溯源技术北京市重点实验室, 北京市预防医学研究中心, 北京 100013)

疾病预防控制系统(以下简称“疾控”)主要承担传染性疾病、慢性非传染性疾病、病媒生物传播疾病等监测与控制,食品卫生、环境卫生、放射卫生和职业卫生健康危害因素的监测与干预任务;突发公共卫生事件如食物中毒的应急处置等。除此之外,还需要进行应用研究,研究对象涵盖生活饮用水中的无机阴、阳离子到病原微生物中核酸等生物大分子。这正好与毛细管电泳(CE)技术擅长的分析对象(从无机离子到细胞)相吻合。CE技术除具有分离时间短、分析效率高、试剂用量少的优势外,还有一项不可替代的优势:方法一旦被充分验证,无需筛选等效色谱柱[1],也无需使用特定的色谱柱[2],可以有效解决色谱柱的选择性[3]不同造成的色谱峰顺序改变的普遍情况[4]。作者单位曾举办过CE在疾控系统应用的学习班,并安排了现场实验:酱油中山梨酸和苯甲酸的测定及饮料中甜蜜素的测定,现场实验结果方法重现性好,与教科书[5]中电泳图的出峰时间基本一样,可见经过充分优化与细致描述的方法易于再现。再加上对细微之处操作的控制,对重现性、再现性和可靠性结果的关键把控[6],完全能够开发重现性和耐用性好[7]、灵敏度高[8]的方法,这也更加充分地体现CE技术在疾控系统应用的优势。

但是,目前我国省级以上疾控机构CE仪器拥有率不足1%,远不如1955年推出的商用气相色谱(GC)、1967年推出的商用液相色谱(LC),更是远远落后于与CE同时起步LC/质谱(MS)的普及率。这是因为LC-MS凭借接口商品化迅速、强大的定性和定量能力,解决了当时急需的食品安全等问题,于2005年之后陆续进入各级标准得以推广,成为省级疾控实验室的标配,并作为不可或缺的常规和科研检测设备,成为解决实际问题时的首选,造成了“色谱难以分离就寄厚望于质谱检测”的现状。但我国目前LC/MS联用仪国产能力不足;对同位素内标的依赖造成检测成本增加;样品难以净化,易污染系统,影响灵敏度。尽管通过清洗离子源,可以解决污染问题,但长此以往,会影响仪器性能。

CE因商业起步较晚[9],性能较好的仪器品牌少、普及率不高、市场认可率不及LC等原因[10,11],较少进入各级标准。事实上,经过30多年的发展,CE已经逐步成熟,在多个应用领域(如在样品量极为稀少的交链孢菌毒素[12]二级标准物质定值方面)均有出色表现[13],尽管如此,CE方法在各级标准普及和推广方面还存在阻碍因素[14]。2018年,美国、英国、欧洲、日本、印度、巴西、俄罗斯和中国已在农业、环保、食品、饮料、化工、制药方面制定了83个CE标准方法[15]。其中,我国有5项标准,《中国药典》2015版收录了4项,行业标准SH/T 1687-2000转换而来的国家标准1项。该国家标准是关于工业用精对苯二甲酸(PTA,大宗化学品,2018年底全球产能已达到8 800万吨/年)质量的检测方法,分别用CE和LC对其中两个主要痕量杂质对甲基苯甲酸和4-羟基苯甲醛进行分析,CE法分离时间短、灵敏度更高[16]。 2020年3月31日，我国又发布并实施了水产源致敏性蛋白快速检测的毛细管电泳法国家标准(GB/T 38578-2020)。可喜的是,近年来国产CE仪器公司大幅度增加,目前已达近40家[15]。这为CE技术在我国的推广应用提供了重要的前提。

本文主要从6个方面讨论CE技术在疾控系统应用研究工作中遇到的问题、机遇和挑战。

1 疾病防控中的应用

30多年前,CE作为异型血红蛋白的分离工具[17],以极高的分离速度和极低的检测费用广受欢迎。基于CE方法直接分离病原微生物[18]和某些变异分析[19]的结果均令人满意,但操作稍显复杂,在结果判断上并不十分直观,加之使用者要了解CE的分离原理,因此应用逐渐减少。尽管如此,CE对生物大分子的分析研究证明了两者之间无与伦比的兼容性[20],这也使CE成为传染病检测工作中不可或缺的技术。

1.1 聚合酶链式反应(PCR)产物分析

DNA分析是传染病检测中最为常见的研究对象。作为常量分析工具,CE检测PCR产物成为疾病检测的重要工具之一,也是CE最为广泛的应用。通过PCR引物设计,可以特异性扩增某种病原微生物特定位置上的核酸片段,使用CE分离PCR产物,通过迁移时间判断扩增的片段长度,从而确定是否存在某种病原微生物。这项技术已经成为众多微生物实验室必备,几乎可以检测所有病原微生物。日常检测中,常用CE与多重PCR(在一个反应体系中进行多组PCR)联用,同时检测多种病原微生物或型别,其借助的正是CE高分辨率的优势[21,22]。Jiang等[23]建立了13种病原微生物的多重PCR扩增和CE分离鉴定方法,包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、军团菌、百日咳杆菌、结核菌、白喉杆菌和A群链球菌。针对这些病原微生物的16S rRNA基因等多个基因的序列设计多种引物,其中正向引物5′端用5′-羧基荧光素(FAM)进行荧光标记。这些引物分为3组进行多重PCR,产物长度从93个碱基对(bp)到903 bp,片段间差异最小为17 bp。在ABI 3730 DNA分析仪上使用商品化分离胶和DNA标准品,分离3个多重PCR产物的混合物,所有产物峰均完全分离且重复性良好,检出限为10-7～10-2mg/L核酸。康央等[24]根据恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体、莫氏立克次实体、土拉弗朗西斯菌、贝氏柯克斯体、问号钩端螺旋体和巴尔通体的特异性基因,构建特异性嵌合引物多重PCR方法,用CE分离扩增产物并鉴定这些重要鼠传疾病。该方法中CE的分辨率是琼脂糖电泳的10倍以上,CE-多重PCR方法的灵敏度与实时荧光PCR相当,在实际样本检测中阳性率达到普通PCR方法的3倍以上。Hu等[25]建立了基于GeXP多重PCR的肠道病毒(EV)检测方法,可通过PCR片段长度区分中国常见多种手足口病原微生物,如EV71、A组柯萨奇病毒(CVA)16和CVA 4、5、9、10以及B组柯萨奇病毒(CVB) 1、3和5,其中片段长度差异最小为12 bp。核酸检测相对比较简单,而且灵敏度超高,但是很容易出现实验室环境被PCR产物污染的情况,造成假阳性。因此采用CE分析PCR产物时必须在特定的房间中进行。应用荧光探针技术的实时荧光PCR技术在很大程度上能够解决产物分析时的污染问题,但扩增片段较短,无法用于测序,因此,CE-PCR依然在测序分型检测中有应用。

1.2 核酸序列测定

目前,基于CE原理的第一代核苷酸序列测定已经发展成为完全成熟的常规技术,常用于传染病病原微生物检测和PCR产物核苷酸序列测定(简称测序)。虽然通过引物设计可以确定PCR产物长度,并在CE图谱上直接进行判定。但也会有例外。如病毒在复制过程中有可能出现核酸的插入、缺失、重组等,可能造成片段长度发生变化,就需要对PCR产物测序进行验证。此外,基因分型检测需要在CE分离的基础上进行测序,从而判定病毒的基因型。比较典型的应用是诺如病毒感染疫情中对病毒的分型鉴定。刘园等[26]在同一地点连续3次诺如病毒疫情的检测中,首先对诺如病毒核衣壳蛋白基因进行逆转录(RT)-PCR, CE分离的阳性PCR产物为344 bp的DNA片段,经测序和序列比对后发现3次疫情由不同型别的病毒引起,从而认为未能正确消毒是导致疫情连续出现的原因。这种特定基因片段扩增与CE为基础的测序联用的方式可鉴定绝大多数病原微生物,但测序只是此类研究中不可或缺但又是很小的组成部分,因此本文不再赘述此类方法在其他病原微生物鉴别中的应用。Clarridge[27]综述了细菌性传染病检测中,细菌核糖体16S rRNA编码基因测序分析对临床微生物学和传染性疾病的影响。对于厌氧菌、生长缓慢的细菌以及难以根据生化特征进行鉴定的细菌而言,16S rRNA是非常可靠和方便的鉴定方法。为了满足基因组研究中测序的高通量要求,第二代测序技术应运而生。虽然测序原理已经和CE没有任何关系,但芯片毛细管电泳依然可作为第二代测序文库制备中的质量控制工具,对原始基因组DNA、文库长度分布情况、未反应的接头比例、文库扩增效率等文库质量参数进行评估[28]。芯片毛细管电泳已超出了本文讨论范围。

1.3 变异和分型分析

对DNA变异的检测和在此基础上的分型分析是CE的一项重要应用。核酸变异通常需要PCR产物测序检测核酸变异,但测序程序相对复杂,而且发生变异的情况比较罕见,通常使用一些快速筛选方法检测到变异,然后对变异片段进行测序验证。当前变异研究的热点之一是对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的检测,主要用于癌症等疾病的分型、风险评估等,在传染病疫情的流行病学调查和溯源中也有一定应用。Studzińska等[29]对toll样受体3和7基因上的5个SNP分型与巨细胞病毒感染相关性进行了研究,采用限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,使用QIAxcel自动化CE仪器和商品化DNA筛查试剂盒,根据不同的电泳条带组合确定了SNP基因型。通过比较感染和未感染巨细胞病毒的患儿基因型发现TLR3 L412F杂合子是感染的风险因子。2019年Takahashi等[30]建立非杂交法的CE检测SNP技术。应用CE可以在未杂交的基础上区分出只有一个碱基差别的DNA片段。该方法的特点之一是采用了酸性分离条件(8 mol/L尿素和0.5 mol/L磷酸盐缓冲液)区分不同碱基的解离程度。在ALDH-2基因的84-mer单链DNA中仅有一个G/A突变。CE能够完全分离正常的单链DNA及其互补链、突变的单链DNA及其互补链。

片段分析中采用非变性CE分离单链或双链DNA会获得一些有趣的结果。单链DNA在非变性条件下快速变性后复性时,会出现单链内部碱基配对的现象,形成特定的单链构象,这种构象决定于核苷酸序列。非变性CE能够分离长度相等但序列不同的单链。这项技术称为单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)。在细菌性疾病的分子诊断方法中,CE-SSCP能够发现单碱基变异,基于CE-SSCP结合16S rRNA基因片段PCR技术,能以简单的步骤分离序列变异,各标记峰基线分离良好,具有特征性迁移率,便于病原微生物鉴定。Lin等[31]采用巢式PCR和CE-SSCP分析了肺炎支原体23S rRNA基因上耐药变异,采用线性聚丙烯酰胺和聚乙二醇20 000和三羟甲基氨基甲烷-硼砂-乙二胺四乙酸(TBE)缓冲液(pH 8.3)作为筛分介质,能够快速鉴定肺炎支原体红霉素耐药变异株。传统的CE-SSCP系统分辨率有限,不能将大多数16S rRNA基因特异性标记分离成单独的峰。Phillips等[32]报道高分辨率的CE-SSCP体系可以有效地分离高度相似的PCR产物,实现了12种病原微生物同时检测的方法。

另外一个与核酸片段长度有关的DNA片段分析方法是多位点串联重复多态性分析(MLVA),通过细菌基因组中多个串联长度多态性位点(VNTR)的重复数来区分各种菌株。刘桂荣等[33]在宋内志贺菌中10个VNTR位点,采用3730 DNA分析仪和商品化试剂盒对在北京市分离到的50株志贺菌进行MLVA分析,发现了21个型别,为预测志贺菌流行奠定了基础。

1.4 食源性致病菌分析

病原微生物引起的食源性疾病是一个巨大、广泛且日益严重的公共卫生问题。传统的基于培养的技术非常耗时,难以实现大规模筛查。Roda等[34]综述了1999～2012年食品基质中病原微生物快速生物分析方法的进展,并特别强调了为实现多种病原微生物同时检测设计的技术解决方案。Zhou等[35]建立了一种以SYBR Gold为核酸荧光染料,结合双重PCR检测食品中致病性小肠结肠炎耶尔森菌的毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)新方法。小肠结肠炎耶尔森菌是一种革兰氏阴性的小杆状细菌,在食物、水和其他自然样品中普遍存在,并能在冷藏中生存。目前至少有3起由小肠结肠炎耶尔森菌引起的疫情报道。欧洲、新西兰和美国已将小肠结肠炎纳入国家常规监测网络。CE-LIF法避免了PCR-琼脂糖凝胶电泳的缺点,可以检测低浓度的细菌。与表型试验相比,可快速、灵敏、可靠地区分致病菌株和非致病菌株。

与细菌相比,以轮状病毒、诺如病毒、星状病毒等腹泻病毒为主的病毒正在成为全球性的公共卫生问题。张建明等[36]综述了CE在病毒学研究领域的应用。与生物样本不同,食品的成分非常复杂,还有可能含有PCR抑制剂成分,使得食品的病毒核酸提取和后续扩增反应更加困难,除上述PCR加测序的方法外,以CE为基础的、灵敏可靠的食品中病毒的检测方法较少。Ruan等[37]建立了以SYBR Gold为核酸染料,经碱性缓冲液洗脱-聚乙二醇沉淀后的RT-PCR检测各种蔬菜样品中的食源性肠道病毒的CE-LIF新方法。该法操作简单,环境友好,不需要昂贵的仪器和探头,这使得它特别适用于发展中国家。

如前所述,PCR是DNA/RNA分析的支柱,理想情况下能够检测到一个或几个目标分子。然而,在分析食品或法医样品时,经常受到低质量模板分子和复杂基质的挑战。Hedman等[38]综述了生物恐怖主义防备、食品安全和法医学中PCR工作流程的验证指南,在发生食源性疫情或需要分析大量不同样本的犯罪事件时,能够进行合理的内部验证,以实现可靠和快速的质量保证。

1.5 疫苗分析

赛诺菲-安万特、默克和惠氏等疫苗制造商都在用CE进行疫苗分析[39]。Nunnally等[40]基于有限的24篇文献和参加的学术讲座,综述了CE分析疫苗的进展,认为制药公司因保密的原因,导致CE在疫苗分析中的实际使用情况被低估。

Hsieh等[41]用CZE-UV方法鉴定和表征传染性法氏囊病病毒亚病毒颗粒,为疫苗生产过程中的质量控制、对病毒感染产生的血清抗体的监测或疫苗免疫提供了支持。van Tricht等[42]利用在线CZE快速而准确地测定腺病毒在疫苗生产中的浓度,目的是取代标准的定量聚合酶链反应(qPCR)方法,后者需要至少一天的时间才能对一个样品获得可靠的结果;同时,用统计学方法评价了CZE和qPCR方法之间的等效性。CZE法从采样到报告结果的时间不到2 h,而qPCR需要3 d,可见CZE法在下游分析中所需时间更短。研究团队对来自分析方法的关键数据进行广泛的系统适用性测试和趋势分析,确保经过2年的运行,在525次分析后,该方法的精密度和偏差仍符合要求。Rustandi等[43]以单克隆抗体(MAb)、Enbrel、CRM197和弥散性梭菌(Clostridium Diffi Cile)疫苗蛋白为例,说明了基于CE的Western Blot技术的实用性,测定了4种来自白念珠菌疫苗的毒素蛋白。van Tricht等[44]还建立了快速准确鉴定和定量流感疫苗中多种病毒蛋白的毛细管凝胶电泳(CGE)新方法。CGE法可在与LC法相同的分析物浓度范围内使用,但具有更好的精密度和准确度。总体而言,CGE方法的总分析时间要短得多,可在4 d内分析100个样品,而单细胞免疫扩散(SRID)需10 d。吴蕴怡等[45]建立了CZE分析肠道病毒71型灭活疫苗纯度的新方法,为该疫苗的质量研究、工艺过程控制及稳定性研究奠定了基础。用CE测定脑膜炎球菌结合疫苗原液中二甲亚砜残余量、四价轮状病毒疫苗原液中蔗糖含量也已见文献报道[46,47]。

综上,CE已被证明是疫苗表征的一种极好的替代技术。对于分析者来说,CE提供了自动化程度高,更容易的方法开发/验证。与使用各种不同的方法和不同的技术相比,仅用CE就能够监控10步过程的每个步骤中的重要参数[48],完全满足包括疫苗定量、纯度、pI测定、过程监控、表征和核酸分析的要求。由于疫苗分析需要分子生物学、生物化学、免疫学和病毒学以及分析化学多学科联合,导致CE在疫苗分析中的巨大应用潜力还未被充分挖掘,有进一步提升的空间。

2 食品(保健食品、特医食品)中营养或限量物质的分析

在分离结构相似的化合物方面,CE比LC具有更好的效率[49],容易被忽略的事实是:第一,LC流动相和GC前处理消耗的大量有机溶剂很难回收[50],尽管一些超高效液相色谱(UPLC)极大地减少了有机溶剂的消耗,但与CE相比仍相当可观。第二,GC或LC经常需要衍生或净化样品等,样品前处理需要的耗材多,分离用的色谱柱较昂贵[51-53],对一些需要控制成本的第三方检验机构或经费不足的单位,成本较高。第三,极性分子在普通LC非极性色谱柱上的保留弱,难以与弱保留的食品基质分离。即使采用离子对试剂、改变色谱柱类型等手段改善分离,但仍然存在或多或少的干扰,尽管通过更换色谱柱和流动相或通过二极管阵列检测器辅助排除假阳性,但实际效果十分有限,因为分离机理没有根本变化。第四,GC或GC-MS样品前处理繁琐复杂,如甜蜜素[54]等,检测1个样品(从称样、前处理直至上机测定)往往需要1 d的时间,因为前处理花费半天,而CE则可以在1 h内完成[55,56]。

CE已显示出在具有挑战性的食品分析中的巨大应用潜力[57],有代表性的应用实例如饮料[58]、牛奶[59,60]、面粉[61]、鱼[62]、豆芽[63]、橄榄油[64,65]、食用油[66]、蔬菜[37]、酱油[67,68]、啤酒[69]、红酒[70]、茶叶[71]、婴儿配方奶粉[72-74]、功能食品[75,76]、蜂蜜[77]、猪肉和鱿鱼[35]、特殊医学用途配方食品[78]、海藻[79]、蜂王浆[80]等。CE不仅是分析强极性和稀少样品的有力工具,而且也是检查中成药中违法添加西药的利器,因为西药添加量必须达到药物的剂量(高达上千个mg/kg[76])才能起作用,显然利于CE分析。

CE还可为样品前处理提供新思路。工业染料因着色牢固、价廉、高温稳定以及较少添加量即可达到理想着色效果[81],被滥用于食品着色。文献报道的碱性橙2的LC或LC-MS法受限于色谱柱,不能用太强的酸或碱提取,通常用甲醇-乙腈[82]、乙醇[83]、酸化甲醇[84]或碱化甲醇[85]、乙腈[86]、酸化乙腈[87]、碱化乙腈[88]等提取。LC的回收率一般在77.8%～83.6%之间[89],难以达到90%。我们的研究表明:只有60%乙腈联合20%乙酸才能有效提取,碱性橙2的回收率在90%。CE提取剂不受毛细管的限制,酸、碱、表面活性剂、有机溶剂等均可选择。LC-MS检测方法[90]首先用1 mol/L HCl提取,之后再调节pH,最后用SPE柱净化,过程繁琐且增加了检测成本。由此可见CE是分析着色剂的首选。

CE对食品卫生变得越来越重要且应用前景广阔。董亚蕾等[91]和Lara等[92]分别综述了2009～2012年、2008～2018年CE在食品安全分析中的应用。Lara认为CE在食品常规分析中取得了重要进展,样品前处理并不是CE的瓶颈[92]。Ibáez等[93]综述了2011～2014年CE在食品和食品组学中的应用。de Oliveira等[94]综述了1995～2015年这20年CE分析食品中氨基酸、蛋白质、碳水化合物和脂质的研究进展,并指出CE是工业和政府实验室进行质量控制的有力工具。Papetti等[95]综述了CE技术的历史、原理和应用以及2003～2017年CE在不同类型食品中最重要的应用进展,显示出CE从小分子到大分子(离子、药物、蛋白质、天然产物)分析中巨大的应用潜力。成为食品质量和安全、食品加工和稳定性以及食品工业的重要分析工具。

食品化学家、监管机构和质量控制实验室都在寻求更强大、更清洁和更便宜的分析方法[96],食品分析目前正朝着绿色分析化学方向发展[96],这对绿色环保的CE技术是利好。但CE易于受温度、吸附、纳升进样量的精度等因素影响,CE准确定量的关键就是了解并控制这些影响因素[7]。法规实验室在使用CE之前,必须进行充分验证,以证明新开发的CE方法不是那些仅用标准溶液测试的性能良好的方法,否则,它很难被接受为标准方法[97]。

3 化妆品中禁限用物质的分析

由于化妆品为重要的全球产业,各国对化妆品均进行严格监管,以保证其安全。但生产企业违法行为时有发生,例如故意使用禁用物质或过量使用限用物质、非法添加、标签上声明的成分与实际不一致等。我国由化妆品质量引起的各类皮肤不良反应等安全问题时有发生[98,99]。检验机构应依据《化妆品安全技术规范》(2015版)(以下简称《规范》)对上市前或监督抽检的化妆品进行依法检验。目前《规范》中禁限用组分共收录1 745种,配套的理化检验方法77个[100],涉及304种组分,这就意味着1 441种组分无相应检测方法。擅自非法添加法定检验方法之外的速效美容化合物的现象已相当普遍[3,101]。另外,各国关于化妆品的法律法规不同,在我国禁用的中药成分,在韩国则允许添加[102],这也给化妆品检验带来了挑战。化妆品成分复杂,基础配方一般包括:油脂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、色素、香料等。某些特殊用途化妆品还添加保湿剂、增稠剂、染发剂、去屑剂、紫外线吸收剂等,既有油包水,也有水包油的配方。从化妆品基质中将80%以上目标物提取出来并净化,实现准确定量具有挑战性[103]。因为成千上万个产品的配方不尽相同,而《规范》中的检验方法在研制时,也不可能考察全部市售产品的基质,这就导致了《规范》中大多LC方法分析实际样品时,总是存在干扰。

尽管分析化妆品样品时采用的前处理方法多样,但实际工作中,液-液和固-液萃取是化妆品分析中主要的样品提取方式[104]。《规范》中大多数LC采用甲醇提取后直接进样,甲醇对表面活性剂、增稠剂等也有溶解能力,导致这些组分一同被提取并进入色谱柱,产生不可逆吸附,柱效迅速下降,增加了检测成本。当用LC测定乳状化妆品时,滤膜过滤会导致待分析物的损失,然而,若不过滤则很快使色谱柱失效[105]。而CE可将悬浮液直接进样。即使测定化妆品中铅、镉和汞时,也无需复杂的样品前处理,利用响应函数法并结合胶束电动毛细管色谱法测定个人护理产品中潜在香料致敏原和防腐剂同样无需样品前处理,显示了CE的优势[106]。与原子吸收光谱法的单元素测定相比,CE具有多元素分析的能力,与电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)相比,单样品检测的成本相对较低,所需的设备成本也相对较低[107]。此外,ICP-MS还存在传质效率较低、光谱/非光谱干扰等局限性[106]。CE还用于化妆品中非离子表面活性剂的表征和测定[108]，相对分子质量低(380 kD)和相对分子质量高(2180 kD)的透明质酸(Hyaluronic, HA)混合物[109]的测定,红藻生物活性的评价[110],香料[111],个人护理产品中三氯生[112],美白剂和对羟基苯甲酸酯[113,114],防腐剂[115-119],紫外线吸收剂[120],异烟酰胺和烟酰胺[121],苯酚、氢醌、熊果苷和曲酸[122],有机酸[123],烟酸[124],糖皮质激素[125],迷迭香酸[126]等的测定。目前文献报道利用CE检测化妆品的文献不如食品的多,但一旦认识到CE分析化妆品的优势,使用者便爱不释手。

4 消毒产品或日用品中消毒剂有效成分分析

我国自2003年遭遇SARS之后,又相继遭遇禽流感,直至当今的新型冠状病毒肺炎,说明病毒性传染病仍居各种传染病之首[127]。抗病毒药物的使用也日益广泛。但一些抗病毒药物可能会导致严重的不良后果[127,128]。有企业却将禁止使用的抗生素、抗真菌药物、激素和抗病毒药物等物料,违法添加到消毒和抗抑菌产品中,以增加消毒或抗抑菌效果。此外,消毒产品剂型有膏剂、霜剂、凝胶、水剂等,与药品的界定比较模糊,消费者不容易甄别[129]。由于消毒产品中违禁药物的添加未能像食品中非法添加那样受到重视,故缺乏相应配套检验方法。基于色谱筛查、质谱确证的原则,我们分别建立了LC[130]和CE[131]同时测定更昔洛韦、阿昔洛韦、喷昔洛韦的方法,阳性样品用LC-MS/MS方法确证。利巴韦林因亲水性强且无特征紫外吸收,难以用LC分析,故我们仅建立了CE的测定方法[132]及阳性样品的LC-MS/MS确证方法。

消毒剂中允许使用的有效成分种类远少于化妆品,利用CE检测消毒剂有效成分的文献不如化妆品的多,Kulapina等[133]综述了合成表面活性剂的CE测定方法。消毒剂有效成分使用的极性分子较多,如用于物体表面消毒的季铵盐、次氯酸钠[134,135]等,为增加消毒效果,配方中经常使用表面活性剂、高分子聚合物和中药提取物。监督抽检要求使用国标进行依法检验,然而现有消毒剂国标中涉及的检测方法有滴定法、分光光度法、GC法和LC法。滴定法和分光光度法常因复配成分干扰而难以获得准确结果[136],GC法适合易挥发、极性不强的化合物分析,故大多数有效成分的分析只能用LC进行测定,但消毒剂中复配的基质易不可逆地吸附在色谱柱上,使柱效下降。对于无生色官能团的季铵盐,一般采用通用型检测器如电导或蒸发光散射检测器,易产生干扰,而且电导检测不能使用梯度洗脱且平衡时间长;蒸发光散射检测器分析实际样品时,线性范围窄且测定结果不理想。因此有必要弥补国标中消毒剂现有检测方法在成本、效率、环保等方面的不足,而CE无疑是首选。我们用文献方法[137,138]检测最近几年监督抽检的样品时,发现未如实标识有效成分的现象依然存在。正是由于CE是目前唯一能够区分聚六亚甲基双胍和聚六亚甲基单胍的方法,2016年对GB 26367-2010[139]进行修订时,将CE方法纳入资料性附录里,新版标准号也相应变为GB/T 26367-2020。此外,CE检测苯扎氯铵的方法也被纳入新修订的GB/T 26369-2020季铵盐消毒剂卫生要求的国家标准。这两项新修订的国家标准已于2020年6月2日发布,将于2021年1月1日正式实施。这两个CE方法的纳入,必将带动更多的CE方法逐渐进入国家标准。

5 能力验证

能力验证可展示实验室的技术能力,确定新检测方法的有效性,增加客户和政府有关部门对实验室的可信度等。本实验室2008年利用CE测定了乳及乳制品能力验证样品中的三聚氰胺[140],获得了满意结果。之后利用文献方法[141,142],完成了英国弗帕斯实验室食品分析水平评估(FAPAS)中软饮料、果酱、肉泥、蔬菜泥、牛奶、糕点等6大类7种食品中咖啡因,可可碱等的13次能力验证,测试结果Z(标准分数)绝对值均小于2,部分指标的Z值小于0.5,远远高于现行的实验室分析方法。最近,我们利用已建立但未发表的硝酸盐和亚硝酸盐同时分析的CE方法,完成了奶粉、蔬菜泥、肉泥中硝酸盐和亚硝酸盐的国内外能力验证,Z值均小于1;其中莴苣泥、甘蓝泥、肉泥和奶粉中硝酸盐和亚硝酸盐的电泳图见图1。根据样品含量及基质干扰情况,可裁短并改用内径50 μm毛细管,以减少分析时间,这也是CE较其余色谱方法的方便灵活之处。所有样品均加入提取液(将分离缓冲溶液用水稀释10倍作为提取液)超声提取30 min,蔬菜泥和肉泥在9 000 r/min离心10 min,上清液直接进样,奶粉样品于4 ℃、14 000 r/min离心10 min,上清液过0.45 μm滤膜后进样,若用60 000 r/min离心,则上清液直接进样。

图 1 能力验证样品的电泳图Fig. 1 Electrophoregrams of proficiency test samples CE conditions: running buffer: 90 mmol/L Na3PO4 (without pH adjustment) containing 0.5 mmol/L cetyltrimethylammoniumbromide; sample buffer: 1∶10 dilution of the running buffer; injection pressure: 3448 Pa; detection wavelength: 214 nm; temperature: 25 ℃; capillary: a, d, e. 75 μm×70 cm (effective length 60 cm); b. 50 μm×70 cm (effective length 60 cm); c. 50 μm×50 cm (effective length 40 cm); separation voltage (kV): a. 8; b. 14; c. 10; d. 8; e. 8. Current (μA): a. 93; b. 85; c. 86; d. 93; e. 93. Injection time (s): a. 12; b. 15; c. 10; d. 12; e. 12. Samples: a. lettuce purée; b. cabbage purée; c. meat; d. e. infant formula. Peaks: 1. nitrite; 2. nitrate; 3. chloride.

正是有了上述的技术储备,我们才能于2016年处置有毒雪碧样品时,将该法稍作调整,快速排查出次氯酸钠[143]。说明CE方法的重复性、再现性及其准确定量能力不容置疑。

6 食物中毒事件应急分析

食物中毒事故发生后,疾控系统的职责就是要快速提供科学、准确的检测报告,为卫生行政部门决策和医疗机构救治提供技术支撑[144],故检测报告的准确性及时效性不但体现着疾控机构的业务能力和技术水平,还体现着政府部门应急反应能力和执政能力[145]。食物中毒原因有微生物性、化学性、有毒动植物等,其中常见化学性中毒因子为亚硝酸盐[146-151]、甲醇[152-156];农药如涕灭威[157-159]、毒鼠强[160-163]、氟乙酸钠[164-166]、氟乙酰胺[167],除草剂百草枯[168-171]等。食物中毒样品种类繁多,毒物含量大部分在成千[146]上百[172]和几十个mg/kg[157]。LC-MS/MS尽管能快速定性确证待分析物,但需要繁琐的样品净化及同位素内标才能准确定量,不利于快速出具检测报告。而CE模式多样、功能强大,开发快速分离方法,通常只需简单的样品制备[173](如血液样品经稀释后直接进样),可弥补LC-MS/MS不能快速定量的不足。这些特点使得CE成为食物中毒应急分析的有力工具。

本实验室用CE处置了3起食物中毒应急事件,第1起为淀粉中可乐定[145,174],CE在2 h内便给出了定量结果为960 mg/kg[172]。第2起为疑似有毒雪碧样品,用CE排查出该样品中含次氯酸钠或84消毒液[143,175],而LC-MS/MS这个大炮面对次氯酸钠这个小蚊子,也束手无策,可见CE这个小技术解决了食物中毒应急分析中的关键问题。第3起为牛奶[176]及服用者血液中脱氢乙酸。受宁夏回族自治区疾病预防控制中心委托,我实验室对其送检的引起28人发病的牛奶及中毒者的血液样品进行检测。在本实验室以前的研究基础上[142],保持毛细管内径不变,而长度由原70 cm减少至30 cm,以实现对样品的快速测定,5 min内即可实现样品分析,完成6份牛奶样品[177]及9名幼儿服用者血液样品的分析仅需2 h,为给中毒者进行对症治疗赢得了时间。牛奶中脱氢乙酸含量在1.83～1.95 g/kg,血液中的含量在0.08～0.26 g/kg,血液样品的电泳图见图2。

图 2 中毒者血液样品的电泳图Fig. 2 Electrophoregram of a blood sample of poisoned patient CE conditions: capillary 50 μm×30.2 cm (effective length 20 cm), separation voltage: 13 kV; injection pressure and time: 3448 Pa for 4 s; detection: 228 nm; temperature: 25 ℃. Peaks: 1. dehydroacetic acid.

上述3起食物中毒事件充分证明了CE成为食物中毒应急分析中不可或缺的有力工具。

7 结论与展望

过去的10年里,CE在疾控系统无论是防病还是卫生理化检验等方面均有出色表现。

在传染病控制工作中,基于CE原理的第一代基因测序仪在2020新型冠状病毒检测中发挥了重要作用,显示CE在核酸测序和片段分析上仍占据重要的一席之地,但是,许多CE的应用都有了对应的分子生物学方法,如Sanger测序与新一代测序、SNP分析与芯片分析、SSCP与高分辨溶解曲线分析等,使CE技术得到了有效的补充。随着CE-PCR系统的日益发展,加上扩增反应或预富集步骤,能够在一次运行中检测到许多不同的食源性病原微生物。但快速、简单、经济、高灵敏度和耐用的食品基质中细菌和病毒检测仍然是一个发展方向,但也是挑战。

食物中毒公共卫生事件一般具有突发性、普遍性、非常规性及事件规律难掌握、局势难控制、本质难判断、损失难估量的“三性四难”的特征。食物中毒应急分析具有时间紧、任务重、强度大、责任和压力重等特点。送检的样品除基质复杂的食品样品外,还涉及血样和尿样等生物样品,样品量一般较少,无法重复采样。中毒因子中极性小分子较多,科学地选择检测技术显得特别重要。只需简单样品制备程序的CE分离模式多、功能强大,非常适合食物中毒的快速应急分析,是CE在疾控领域的特色应用,也是未来疾控领域需要加强的研究方向。

我国吸附无细胞百白破联合疫苗(DTaP)不良反应发生率居我国计划免疫接种的多种疫苗的首位。生物活性极高的纳克级内毒素可引起发热和其他病理反应,一些相对分子质量小、含量低(nmol/L)的毒素,亦被认为是导致DTaP疫苗不良反应的原因之一,所以疫苗必须严格控制内毒素的含量。生物制品的管理控制部门,对各种疫苗的最高内毒素含量均有限制性规定,并将内毒素含量检测作为DTaP安全性控制的重要质量标准之一。但快速而准确定量疫苗内毒素的含量一直是挑战,也是疾控领域需努力的方向。

保健食品中免疫球蛋白G(IgG)的国标方法具有成本高、分析时间长和灵敏度不高的缺点,不适合于测定牛奶中IgG。而CE方法尽管成本低、分析时间短,但同样受限于灵敏度,无法测定牛奶中IgG。利用CE实现乳清蛋白(乳铁蛋白、牛血清白蛋白、IgG、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B)的同时分离与测定依然是挑战。加工食品中花生、虾、牛奶、鸡蛋等主要致敏蛋白定量也受限于检测灵敏度。未来需开发新的高效分离体系及灵敏的检测方法,以期进一步提升蛋白检测灵敏度,满足乳品中营养蛋白和致敏源蛋白准确定量的需求。

需求驱动发展。疾控系统的职责之一是依据标准方法进行常规检验。CE在疾控系统的广泛应用取决于标准方法纳入CE方法的数量。随着对CE技术潜能认识的逐渐加深,有强烈需求的基层检验人员、苦练内功的CE应用研究者和不断创新的仪器厂家特别是国产厂家的共同推动。CE分析方法纳入我国标准体系,必将驱使我国CE技术进入良性循环的发展轨道,涌现出更多快速、准确、便捷、灵敏、低成本的方法,有益于基层检测者,成为解决民生问题的重要技术手段。CE在疾控领域的应用具有广阔的发展前景。