正交试验法优选四君子汤的提取工艺

2020-08-26张晓晓冯亚莉翟广玉谢新年

化工设计通讯 2020年9期

张晓晓，冯亚莉，翟广玉，谢新年

（郑州工业应用技术学院药学与化学工程学院，新郑 451100）

四君子汤出自《太平惠民和剂局方》，被历代医家推崇为补气第一方，方中人参性甘温大补脾胃之气，为君药；白术苦温，助君药燥湿健脾，为臣药；茯苓甘淡，健脾渗湿，为佐药；炙甘草甘平，益气和中，调和诸药，为使药。四味药配伍，益气健脾，药性平和，温而不燥，补而不峻，常服无不良反应。现代药理研究结果表明，四君子汤不仅具有补益作用[1]，还具有提高免疫力[2]，调节胃肠功能[3]，促进消化吸收，调节脱氧核糖核酸合成，抗疲劳，修复肝脏，治疗儿科疾病（腹泻、贫血、急性黄疸型肝炎），治疗糖尿病、脂肪肝等药理作用[4]，临床上具有重要应用。

原方中君药人参常由党参代替，若以党参为君药，则四君子汤的功效侧重于补中益气，生津养血[5]。中医学认为脾虚证为衰老的主要原因，若脾气虚弱，机体具有抗氧化能力的防御系统功能下降，从而引起自由基清除能力降低，最终导致机体衰老甚至其他严重的疾病[6]。实验证明，党参方“四君子汤”清除自由基能力优于人参方[7]。

党参中以皂苷类成分为主，主要药用成分为党参炔苷。本文采用正交试验法，以党参炔苷的含量为指标，对四君子汤的水提工艺进行优化。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超声波清洗机（济南巴克超声波科技有限公司）；HPLC-1206 安捷伦高效液相色谱仪；分析天平（上海衡平仪器仪表厂）；色谱柱ZORBAXSB-C18（4.6×250mm，5μm）；HH-2数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司金坛区晶波实验仪器厂）；RE-52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D循环水式多用真空泵（天津华鑫仪器厂）；调温电热套（上海树立仪器仪表有限公司）。

党参，白术，茯苓，甘草（购于新郑市学院路店张仲景大药房，经谢新年教授鉴定为合格药材）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；党参炔苷对照品（PCS：181110，纯度＞98%）。其他试剂和溶剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 水提醇沉

取党参12g，白术9g，茯苓9g，甘草6g，加适量蒸馏水浸泡1h。煎煮三次，每次蒸馏水用量均为500mL，合并三次滤液。抽滤，浓缩药液，在浓缩后的药液中加入无水乙醇使乙醇浓度达到75%，慢加快搅，冷藏，静置沉淀24h，抽滤除杂，得药液；用旋转蒸发仪将乙醇蒸走，并回收乙醇，最后将药液浓缩至100mL。

1.2.2 正交实验

选取浸泡时间、用水计量、煎煮时间及煎煮次数作为考察因素，各因素取3个水平（表1），采用L9（34）正交试验设计筛选最佳工艺条件[8]。样品制备：取党参、白术、茯苓、甘草按照表1正交实验设计方案水煎提取，提取液用真空抽滤放冷备用。

表1 正交实验设计筛选四君子汤煎煮工艺

2 含量测定

2.1 薄层色谱的鉴别

采用薄层色谱法，比较四君子汤及其单味药中石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的化学成分。

2.1.1 供试品溶液的制备

全方水煎液：按照四君子汤中各药的配伍比例取党参9g、白术9g、甘草9g、茯苓6g，加10倍量的水，浸泡0.5h后，煎煮两次，每次1h，合并滤液，减压浓缩至30mL，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并每种萃取液，水浴挥干，残渣加甲醇分别定容至10mL。

药材单煎液：各取党参9g、甘草9g，分别加入10倍量的水，浸泡0.5h后，煎煮2次，每次1h，合并滤液，减压浓缩至一定体积，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并每种萃取液，水浴挥干，残渣加甲醇分别定容至10mL。

2.1.2 展开剂的选择

正丁醇部位，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别至日光及紫外灯365nm下检视。乙酸乙酯部位，乙酸乙酯-石油醚（7∶3）展开，取出晾干，在以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别至日光及紫外灯365nm下检视。

测定结果：正丁醇部位全方和甘草的点均清晰，党参中部分成分清晰。乙酸乙酯部位全方、甘草、党参均清晰，如图1所示。

图1 薄层色谱测定结果

2.2 党参炔苷含量测定

2.2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：ZORBAXSBC18（4.6×250mm，5μm），流动相为乙腈∶水=25∶75；波长218nm；柱温为常温25℃；流量为1.0mL/min；进样量：

10mL[9]

2.2.2 标准曲线的绘制

准确称取党参炔苷对照品0.48mg至1mL的容量瓶中，以甲醇定容，摇匀。取对照品溶液依次稀释为：0.019 2、0.048 0、0.096 0、0.192 0、0.240 0mg/mL的党参炔苷对照品溶液。分别准确吸取上述对照品溶液10μL，按色谱条件进行测定，绘制标准曲线[10]。党参炔苷回归方程为y=14 368x-112.14（R²=0.963 2），其中y为峰面积，x为质量浓度，R为相关因数。表明当党参炔苷进样浓度在0.019 2～0.048 00mg/mL时线性关系良好。见图2。

图2 党参炔苷标准曲线

2.3 水提工艺优选结果

以党参炔苷提取量为参考指标，选择浸泡时间、用水计量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，每个因素选择3个水平，因素水平见表1。按处方比例称取党参，白术，茯苓，甘草各9份，按L9（34）正交表进行实验，实验安排及结果见表2。

直观分析显示，各因素对水提工艺的影响顺序为D＞A＞B＞C。结果表明D，A对提取工艺的影响具有显著性差异，结合实际考虑，确定最佳提取工艺为A3B3C2D3，即浸泡时间为120min，用水计量为12倍，煎煮时间为1h，煎煮次数为3次。准确称取处方量药材3份，按优选工艺进行3次实验验证，结果证明党参炔苷提取量分别为0.235 5，0.240 2，0.236 9，表明该工艺稳定可行。