miR-103和AXIN2在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及意义

王姣 刘蜀蓉 龚玉萍

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是临床最常见的非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma，NHL)，目前其发病率在各年龄段均呈上升趋势。由于DLBCL在免疫表型、生物学特性、预后等方面具有较大异质性，因此探讨新的分子标记物对DLBCL进行准确的临床分型，及提示预后方面具有重要意义。微小RNA-103(MicroRNA-103，miR-103)参与调控各种生物学功能过程，其在多种肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[1]。而轴抑制因子2(Axis inhibitor 2，AXIN2)异常表达可影响细胞正常生长发育，与多种实体肿瘤发生及预后有关[2]。已有研究报道，miR-103、AXIN2与多种疾病发展进程及不良预后关系密切[3,4]，而与DLBCL的关系尚不明确。鉴于此，本研究通过检测DLBCL组织中miR-103、AXIN2表达，并分析其与DLBCL患者临床特征、分型及预后关系。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年1月至2013年12月在本院接受手术治疗的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者110例作为受试对象，将术中切除肿瘤组织分为两部分，一部分常规石蜡包埋，另一部分保存于-80℃低温环境中。110例DLBCL患者男62例，女48例；年龄20～75岁，平均年龄(58.79±15.02)岁；Ann Arbor分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期38例，Ⅲ期25例，Ⅳ20例；淋巴瘤国际预后指数(IPI)评分：低危组(0～2)分50例，高危组(3～5)分60例；血清乳酸脱氢酶(LDH)水平<245 U/L 47例，LDH水平≥245 U/L 63例；血β2微球蛋白(β2-MG)水平<3 mg/L 59例，β2-MG水平≥3 mg/L 51例。另选取同期行手术治疗的85例淋巴结反应性增生患者作为对照组，男49例，女36例；年龄21～74岁，平均年龄(57.46±14.93)岁。所有受试者知情同意，签署知情同意书。本研究经四川大学华西医院伦理委员会批准。2组患者一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入选与排除标准 入选标准：(1)均符合DLBCL诊断标准[5]；(2)术前均未接受放、化疗；(3)术中切除组织均可用；(4)临床资料完整。排除标准：(1)伴有其他血液系统疾病；(2)存在沟通障碍；(3)女性妊娠或哺乳期；(4)存在严重肝、肾功能障碍。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化EnVision两步法检测蛋白表达：采用免疫组化EnVision两步法检测110例DLBCL组织中CD10、BCL-6、MUM1、AXIN2蛋白表达。CD10、BCL-6、MUM1即用型抗体均购自上海信裕生物科技有限公司，兔AXIN2多克隆抗体购自北京百诺威生物科技有限公司。结果判定：CD10、BCL-6、MUM1、AXIN2均定位于胞核，随机选取每张切片5个高倍视野(400×)，由两位经验丰富医师共同统计阳性细胞染色情况。阴性(-)：无阳性细胞染色或阳性细胞染色≤10%；阳性(+)：阳性细胞染色>10%。根据CD10、BCL-6、MUM1染色结果，并结合Hans分类标准[6]：110例患者中生发中心B细胞样(germinal center B-cell-like，GCB)型52例，非生发中心B细胞样(non-germinal center B-cell-like，non-GCB)型58例。

1.3.2 实时定量PCR检测miR-103、AXIN2 mRNA水平：采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测组织中miR-103、AXIN2 mRNA表达水平。按照Trizol法提取DLBCL组织中总RNA，并将其反转录为cDNA，随后以cDNA为模板进行扩增，miR-103内参为U6、AXIN2 mRNA内参为GAPDH。反应条件为：95℃，预变性30 s；95℃，变性10 s；65℃，退火10 s；72℃，延伸15 s；合计40个循环，完成后观察扩增产物特异性。重复3次后整理数据，采用2-ΔΔCt计算miR-103、AXIN2 mRNA相对表达量。本研究以miR-103、AXIN2 mRNA相对表达量<均值者为低表达，≥均值者为高表达。引物序列均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 随访：110例DLBCL患者出院后，由专人以电话形式进行随访，随访日期截至2018年12月31日，随访期间记录患者生存、死亡情况，死亡患者以最后1次随访日期作为截止日期，随访结束后统计5年总体生存率(OS)。

2 结果

2.1 DLBCL组织中AXIN2蛋白表达 DLBCL组织中AXIN2蛋白阳性表达26例(23.64%，26/110)，其中8例(30.77%，8/26)为GCB型，18例(69.23%，18/26)为non-GCB型，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 DLBCL组织中AXIN2蛋白表达情况(En Vision两步法染色×400);A DLBCL组织中AXIN2阴性表达；B GCB型DLBCL组织中AXIN2阳性表达；C non-GCB型DLBCL组织中AXIN2阳性表达

2.2 不同组织中miR-103、AXIN2 mRNA表达水平比较 DLBCL组织miR-103表达水平明显高于对照组淋巴结组织(P<0.05)，AXIN2 mRNA表达水平显著低于对照组淋巴结组织(P<0.05)。见表2。

表2 不同组织中miR-103、AXIN2 mRNA表达水平比较

2.3 DLBCL组织miR-103、AXIN2 mRNA表达与临床特征关系 miR-103表达与年龄、性别及β2-MG水平无关(P>0.05)，与DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI评分、LDH水平及Hans分型有关(P<0.05)；AXIN2 mRNA表达与年龄、性别及LDH、β2-MG水平无关(P>0.05)，与DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI评分、Hans分型有关(P<0.05)。见表3。

表3 DLBCL组织miR-103、AXIN2 mRNA表达与临床特征关系 例

2.4 DLBCL组织miR-103与AXIN2 mRNA表达相关性 DLBCL组织miR-103与AXIN2 mRNA表达呈负相关(r=-0.515，P<0.05)。见图2。

图2 DLBCL组织miR-103与AXIN2 mRNA表达的相关性

2.5 miR-103与AXIN2 mRNA表达与DLBCL患者5年OS关系 110例DLBCL患者5年OS为53.64%(59/110)。miR-103低表达患者5年OS(64.91%)显著高于高表达患者(41.51%)(P<0.05)；AXIN2 mRNA高表达患者5年OS(65.57%)明显高于低表达患者(38.78%)(P<0.05)。见图3。

图3 miR-103与AXIN2 mRNA表达与DLBCL患者OS关系

2.6 影响DLBCL患者预后的因素分析 COX回归单因素分析可知，Ann Arbor分期、IPI评分、Hans分型、miR-103及AXIN2 mRNA表达是影响DLBCL患者预后的不良因素(P<0.05)。进一步多因素分析可知，Hans分型、miR-103及AXIN2 mRNA表达均是影响DLBCL患者预后的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 COX回归分析影响DLBCL患者预后的因素

3 讨论

DLBCL发病原因与免疫功能异常、细菌感染等因素有关，是一种多基因参与的复杂过程。目前，虽然部分DLBCL患者通过治疗可痊愈，但多数患者治愈后复发率高，且复发后死亡率较高，这可能与DLBCL本身具有很强异质性有关。因此，应继续寻找与DLBCL发生、发展相关因子，以提高患者远期生存率。既往研究报道，miR-103、AXIN2异常表达与肺癌、结肠癌等多种疾病临床病理参数及预后有关[7,8]，因此有望成为治疗及评估DLBCL患者预后的新靶点。

miRNA是一类内源性非编码RNA，在细胞分化及肿瘤发生、发展中扮演着重要角色。有研究发现淋巴瘤中miRNA异常表达比其他肿瘤更为明显[9]，这提示miRNA与淋巴瘤发生、发展有关，因此研究DLBCL中miR-103表达具有临床意义。miR-103是miRNA中重要一员，首先发现于人宫颈癌HeLa细胞系中，其广泛存在于人类多种肿瘤组织中，且表达稳定[10]。Ke等[11]研究发现，结肠直肠癌患者miR-103表达上调，miR-103异常表达与细胞增殖、迁移有关。Zheng等[12]研究报道，miR-103在胃癌组织中高表达，其过表达与胃癌患者肿瘤大小及淋巴结转移有关，且生存分析结果显示miR-103高表达者总生存率较低。本研究结果发现，DLBCL组织miR-103表达水平远高于对照组淋巴结组织，与Ke等[11,12]研究结果相似，提示miR-103可能与DLBCL发生、发展有关；且miR-103与DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI评分、LDH水平及Hans分型有关，进一步提示miR-103异常表达可能参与DLBCL发展进程。

AXIN是一类多功能构架蛋白，其在胚胎发育过程中可影响体轴形成，并与某些肿瘤的病情进展有关。AXIN2又称Conductin或Axil，位于人染色体17q23-24。相关研究发现，AXIN2异常表达与多种肿瘤的生物学特性及患者远期生存率有关[13,14]，因此研究AXIN2在DLBCL中表达对提示预后具有重要意义。Hu等[15]研究报道，前列腺癌组织中AXIN2低表达与患者肿瘤生长及术后复发有关，提示检测AXIN2表达可为前列腺癌患者临床治疗及预后提供帮助。本研究中，DLBCL组织中AXIN2蛋白阳性表达率为23.64%，non-GCB型明显高于GCB型，且DLBCL组织AXIN2 mRNA表达水平远低于对照组淋巴结组织，提示AXIN2可能与DLBCL发生及临床分型有关。进一步研究发现，AXIN2 mRNA表达与DLBCL患者Ann Arbor分期、IPI评分、Hans分型有关，与Hu等[15]研究类似，提示AXIN2可能在DLBCL发生、发展中扮演着重要角色。本研究还发现，DLBCL组织miR-103与AXIN2 mRNA表达呈负相关，与Chen等[16]报道microRNA-544可通过调控AXIN2表达促进人骨肉瘤细胞增殖相似，推测miR-103可能靶向调控AXIN2表达。生存分析结果发现，miR-103低表达者、AXIN2 mRNA高表达者5年OS较高，提示miR-103、AXIN2异常表达可能与DLBCL患者远期生存、死亡情况有关；且二者表达均可独立影响DLBCL患者预后情况，进一步提示miR-103、AXIN2表达可作为DLBCL患者预后评估的重要分子标记物。

综上所述，DLBCL组织中miR-103表达上调、AXIN2表达下调，其异常表达与DLBCL患者Ann Arbor分期、Hans分型等临床特征及预后有关，可作为临床治疗DLBCL及评估预后的新靶点。本研究未分析淋巴结反应性增生患者术后5年OS，且miR-103、AXIN2两因子间相互作用对DLBCL发生、发展的影响未深入探讨，接下来应加大样本量继续研究。