火龙果茎植物甾醇对姜黄素纳米脂质体稳定性以及释放性能的影响

黎雨浩，李照莹，周 伟,,*，付调坤，邹立强，彭盛峰，成 策，刘 伟

（1.南昌大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业农村部热带作物产品加工重点实验室，广东 湛江 524001）

姜黄素是一种从姜黄中提取的疏水性多酚，现代医学表明，它具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等多种保健功能[1]。由于其水溶性低、在胃肠液环境中稳定性差等缺点，导致其口服生物利用度极低[2]，严重限制了姜黄素在食品和制药工业中的应用。为了提高姜黄素在水中的溶解度、稳定性以及生物利用度，目前研究中主要采用脂质体、乳液、胶束、纳米粒子等多种载体负载姜黄素。从而改善其理化稳定性和生物可接受率[3]。

脂质体是由磷脂分子在水相中自组装形成的双亲性双层膜球形小泡，由内核水相和磷脂双分子层构成。脂质体的双亲性使其可运载多种亲水性或疏水性的营养分子，从而提高其稳定性和生物可利用率[4-7]。作为一种研究广泛的运载体系，脂质体在药学、化妆品和保健食品等不同领域具有非常大的应用潜力。研究表明，脂质体负载姜黄素可有效提高其水溶性和理化稳定性，从而改善姜黄素在体内外消化过程中的接受率[8]。脂质体具有诸多优势，如生物相容性、无毒性、生物降解性等[9-10]。然而脂质体也有许多缺陷，如在加工、运输和储存过程中容易发生聚集，导致药物泄漏，且其自身稳定性较差，容易受到外界环境的影响，如温度、盐离子以及复杂pH值环境等[11-12]。近年来，研究者对提高脂质体的稳定性进行大量研究，如Pu Chuanfen等[13]研究表明瓜尔胶能提高姜黄素脂质体的稳定性。Tai Kedong等[14]发现添加β-谷甾醇可以提高姜黄素脂质体的稳定性以及生物利用度。Li Ziling等[15]发现采用普朗尼克修饰姜黄素脂质体，可以提高其pH值稳定性和热稳定性。Tian Meiping等[16]采用壳聚糖修饰脂质体以改善姜黄素的口服递送能力。

在传统脂质体的制备过程中，通常会添加一定比例的胆固醇以调节膜的流动性，提高磷脂双分子层的稳定性[17-20]。但胆固醇的存在会增加人体冠心病、动脉粥样硬化等疾病的风险。寻找胆固醇的合适替代物优化传统脂质体的配方对于扩大脂质体在食品和医药领域的应用具有重要意义。植物甾醇是一类重要的植物天然活性物质，它可以抑制生物体对胆固醇的吸收，影响胆固醇在人体内的代谢，抑制胆固醇的生物合成，从而降低心血管疾病的患病概率，此外植物甾醇具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种功能[21]。用植物甾醇代替胆固醇作为构建脂质体的主要膜材料，即可避免胆固醇过多摄入的副作用，还能改善脂质体膜的特性，大大提高植物甾醇本身的生物活性[22]。

目前对于植物甾醇脂质体的研究较少，特别是使用PSP代替胆固醇制备脂质体以运载生物活性物质的研究鲜有报道。本实验考察PSP代替胆固醇对姜黄素纳米脂质体（curcumin-nanoliposomes，NLs-Cur）稳定性以及姜黄素体外释放性能的影响，结果表明PSP可显著提高NLs-Cur的稳定性，且有更好的缓释效果。本实验研究PSP代替胆固醇制备新型脂质体运载生物活性物质，以期为获得更好稳定性和缓释性的脂质体提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PSP由中国热带农业科学院农产品加工研究所采用超声辅助提取法制备[24-25]，纯度达91.2%；姜黄素（纯度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷脂S75（大豆卵磷脂含磷脂酰胆碱71%和磷脂酰乙醇胺10%）德国Lipoid公司；1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenylhexa-1,3,5-triene，DPH） 美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

M-700微射流仪 美国Microfluidics公司；RE52-05旋转蒸发仪 上海亚荣公司；T-6紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；FZ7000荧光光谱仪 日本日立高新技术公司；Zetasizer Nano ZSP 英国Malvern公司；LUMiFuge稳定性分析仪 德国LUM公司。

1.3 方法

1.3.1 火龙果茎植物甾醇姜黄素纳米脂质体（curcuminphytosterol nanoliposomes，PNLs-Cur）的制备

参照前期研究方法[26]，采用薄膜分散法结合动态高压微 射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）法制备火龙果茎PNLs-Cur。将磷脂、植物甾醇、姜黄素溶于无水乙醇中，待完全溶解后，转移至圆底烧瓶，于真空条件下旋转蒸发除去乙醇形成薄膜，随即用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS，5 mmol/L，pH 7.0）洗膜获得粗脂质体悬浊液，80 MPa微射流下处理2 次。最终得到的脂质体悬浊液中磷脂质量浓度为10 mg/mL，姜黄素质量浓度为0.4 mg/mL以及磷脂与PSP不同的质量比（10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1）。以不添加PSP的NLs-Cur作为实验空白。

1.3.2 火龙果茎PNLs-Cur理化性质表征

1.3.2.1 粒径与Zeta电位测定

样品用PBS（pH 7.0，5 mmol/L）稀释10 倍，采用Zetasizer Nano ZSP测定平均粒径、多分散系数（polydispersity index，PDI）以及Zeta电位。样品测定前于25 ℃平衡2 min。

该项指标的使用方式是每个经营年度以全组中考勤最低分作为组内所有人在本经营年度的考勤得分，采用集体利益挂钩个人利益的方式进行考评。旨在以集体荣誉感督促、保障全员参与到课程中来，同时让学生充分理解系统论中个体与系统的关系。

1.3.2.2 膜流动性的测定

参考Peng Shengfeng等[27]的测定方法并稍作修改。用DMSO配制2×10―3mol/L的DPH溶液。采用PBS（pH 7.0，5 mmol/L）将200 μL的脂质体悬浮液与5 μL DPH溶液稀释到5 mL，在25 ℃孵育30 min，孵育完成后于激发波长360 nm、发射波长430 nm的条件下测定荧光强度。脂质体的荧光各向异性（P）由下式计算：

式中：I0,0和I0,90分别为发射光平行于激发光和垂直于激发光的荧光强度；G为光栅校正系数。

由于各向异性与流动性呈反比，所以膜流动性表示为1/P。

1.3.2.3 PNLs-Cur的稳定性分析

参考Tai Kedong等[28]的方法并稍作修改。采用稳定性分析仪测定不同环境条件下PNLs-Cur稳定性。将制备好的样品振荡均匀，倒入样品槽中。测定参数为25 ℃、1 h、扫描间隔10 s、转速4 000 r/min。

新鲜制备的火龙果茎PNLs-Cur以及NLs-Cur，分别调节pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0后静置1 d，再经高速分散均匀后，测定其稳定性。并用相应pH值的去离子水稀释脂质体5 倍，测定其粒径以及Zeta电位。

新鲜制备的火龙果茎PNLs-Cur以及NLs-Cur，分别调节离子浓度至50、100、200、400 mmol/L后静置1 d，再经高速分散均匀后，测定其稳定性。并用相同浓度NaCl溶液稀释脂质体5 倍，测定其粒径以及Zeta电位。

1.3.3 热稳定性

参考Peng Shengfeng等[29]方法并稍作修改。通过测定姜黄素在80 ℃的降解速率评估其在脂质体悬浮液中的热稳定性。负载姜黄素的脂质体以体积比1∶4加入PBS（pH 7.0，5 mmol/L）中，以2 mL离心管分装（每个离心管1 mL样品），然后将离心管置于80 ℃的水浴中，并以加入适量吐温80的姜黄素水溶液作为对照。在预定的时间间隔（0、10、20、30、40、50 min和60 min）中取出离心管并将其置于冰水中冷却，最后在420 nm波长处测定姜黄素吸光度，根据姜黄素标准曲线计算姜黄素的含量。姜黄素标准曲线为y=6.836x+0.029 8，R2=0.999 8，线性范围为0.2～5 μg/mL。

1.3.4 体外释放

参考Chen Xing等[30]的测定方法并稍作修改。对2 种脂质体释放性能进行评估。取2 mL PNLs-Cur或NLs-Cur悬浊液各3 份，置于透析袋中，将透析袋封口置于50 mL的PBS（含0.5%吐温80、10%乙醇，pH 7.0）的溶出介质中。水浴温度为37 ℃，于固定的时间间隔（0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h）各取样2 mL，同时补加2 mL溶出介质于420 nm波长处测定姜黄素的含量。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 磷脂与PSP质量比对火龙果茎PNLs-Cur的影响

表1 不同质量比火龙果茎PNLs-Cur的粒径、Zeta电位以及PDITable 1 Particle size, zeta potential and PDI of curcuminnanoliposomes with different contents of pitaya stem phytosterol

脂质体的稳定性通常受其粒径与Zeta电位影响，研究表明，脂质体粒径越小、电位绝对值越高，脂质体越稳定[31-32]。如表1所示，磷脂与PSP质量比10∶1和8∶1制备PNLs-Cur的平均粒径分别为（81.99±1. 78）nm和（83.76±1.29）nm，均大于NLs-Cur的平均粒径（64.81±1.25）nm，而质量比为6∶ 1、4∶1与2∶1的PNLs-Cur粒径显著（P＜0.05）增大，并且PDI也显著增加（P＜0.05），植物甾醇作为一类有益的生理活性成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化等生理功能，在保持脂质体较小尺寸及较佳稳定性，选定质量比8∶1制备PNLs-Cur。这可能是因为较少量植物甾醇更有助于形成稳定的脂质体结构，而较高的植物甾醇掺入量插入导致空间增大。杨贝贝等[33]研究不同含量的大豆植物甾醇含量对脂质体粒径的影响，发现随着大豆植物甾醇含量的增加，脂质体的粒径逐渐增大。赵航[34]研究不同含量的混合植物甾醇、β-谷甾醇及豆甾醇对脂质体粒径的影响，发现随着植物甾醇的含量增加，脂质体的粒径随着增大。这与本实验结果一致。后续选择质量比为8∶1分析火龙果茎PNLs-Cur的稳定性因素。

结果表明，所有PNLs-Cur或NLs-Cur间电位都相差不大，说明PSP的掺入对其电位无显著影响。这是由于甾醇缺乏电荷，脂质体的Zeta电位大小主要由卵磷脂决定[28]。

2.2 膜流动性

膜流动性大，脂质体的稳定性差，药物释放越快[35]，降低膜流动性可以显著提高脂质体的稳定性和缓释性。Mora等[36]研究发现，将甾醇加入膜中可以促进甾醇的侧链与磷脂酰基链的疏水作用和范德华力。Bui等[37]发现加入胆固醇、羊毛甾醇或其衍生物均可以降低膜流动性，且可改善膜的硬度。Tai Kedong等[14]发现加入β-谷甾醇均可降低膜流动性，但是磷脂与β-谷甾醇的比例为2∶1时却没有降低膜流动性的效果。

PNLs-Cur与NLs-Cur的膜流动性值（1/P）分别为7.06±0.01与10.06±1.14。可以看出加入PNLs-Cur的膜流动性相比于NLs-Cur显著（P＜0.05）降低，这说明加入PSP的脂质体形成了更加致密 的双层膜，这与其他学者的结果一致[37]。

2.3 pH值稳定性

表2 pH值对PNLs-Cur的粒径、表面电荷的影响Table 2 Effect of pH on the surface charge and average particle size of PNLs-Cur

表3 pH值对NLs-Cur的粒径、表面电荷的影响Table 3 Effect of pH on the surface charge and average particle size of NLs-Cur

由表2、3可以看出，脂质体的表面电荷在pH 2时为正，pH 3时为负，磷脂S75的表面电荷在pH 2～3之间变为零，这与Peng Shengfeng等[27]发现一致。经1 d贮藏后，PNLs-Cur与NLs-Cur在pH 3以及pH 4粒径都有显著增大，并且PDI显著增加，这可能是由于单一磷脂S75制备的姜黄素纳米脂质体在pH 3以及pH 4的时候聚集，相互之间融合。

图1 NLs-Cur与PNLs-Cur在不同pH值条件下的透光率曲线Fig. 1 Transmission pro files of NLs-Cur and PNLs-Cur at different pH conditions measured by LUMiFuge

图2 不同pH值条件下NLs-Cur（A）与PNLs-Cur（B）的不稳定性指数Fig. 2 Instability index curves of NLs-Cur (A) and PNLs-Cur (B)under different pH conditions obtained by software of LUMiFuge

通过LUMiFuge仪器软件可以获得一系列时间与空间相关的投射曲线。红色曲线表示较早的扫描曲线，绿色为较晚的扫描曲线，曲线变化是由于脂质体在离心条件下相互聚集沉积在样品槽底部，从而导致样品槽不同部位的透光率发生变化[38]。由图1可知，在相同pH值条件下，NLs-Cur的迁移快于PNLs-Cur。通过不稳定性指数曲线分析（图2），可更好地说明在离心条件下PNLs-Cur以及NLs-Cur稳定性差异[38]，这表明在相同pH值条件下PNLs-Cur的不稳定性指数均小于NLs-Cur。这是可能是因为PSP的存在使得脂质体的膜结构变得更加稳定。

2.4 离子稳定性

表4 离子强度对PNLs-Cur粒径、表面电荷的影响Table 4 Effect of the ionic strength on the surface charge and average particle size of PNLs-Cur

表5 离子强度对NLs-Cur粒径、表面电荷的影响Table 5 Effect of ionic strength on the surface charge and average particle size of NLs-Cur

由表4、5可知，随着NaCl浓度的增加，脂质体的Zeta电位绝对值均相应减小，这可能是因为NaCl的静电屏蔽作用[39]。Peng Shengfeng等[27]的研究发现，磷脂S75构建的脂质体在不同的NaCl浓度下的粒径变化不大，这与本实验结果一致。且发现随着NaCl浓度上升，脂质体的平均粒径会呈先略微上升再下降的趋势，这可能是因为脂质体膜上的离子梯度导致水分从其内部流出[39-40]。

图3 NLs-Cur与PNLs-Cur在不同离子强度条件下的透光率曲线Fig. 3 Transmission pro files of NLs-Cur and PNLs-Cur under different ionic strength conditions measured by LUMiFuge

由图3、4可知，在0～200 mmol/L的NaCl浓度之间，PNLs-Cur的稳定性显著优于NLs-Cur，不稳定性指数可以得出，PNLs-Cur不稳定性指数均小于NLs-Cur，说明PNLs-Cur在相同离子浓度条件下的稳定性好于NLs-Cur。

图4 NLs-Cur（A）与PNLs-Cur（B）在不同离子强度条件下的不稳定性指数Fig. 4 Instability index curves of NLs-Cur (A) and PNLs-Cur (B)under different ionic strength conditions obtained by software of LUMiFuge

2.5 热稳定性实验结果

图5 PNLs-Cur与NLs-Cur在80 ℃姜黄素的降解率Fig. 5 Degradation rates of curcumin in PNLs-Cur and NLs-Cur at 80 ℃ within 60 min

脂质体的热稳定性是评价其在加工和应用过程中的一个重要指标，因此评价了PSP对NLs-Cur热稳定性的影响[15]。如图5所示，在80 ℃的处理下，前10 min姜黄素的降解较快，PNLs-Cur与NLs-Cur分别下降了17.61%和21.4%，而此后姜黄素降解逐渐变缓，这与Li Ziling等[15]的研究结论一致。姜黄素在PBS中降解速率非常快，前10 min已经降解46.1%。处理60 min后，PNLs-Cur和NLs-Cur的姜黄素保留率分别为61.25%和57.48%，而姜黄素溶液保留率显著（P＜0.05）低于P NLs-Cur与NLs-Cur，仅为17.21%。证明将姜黄素包埋在脂质体中可以有效提高其热稳定性，这与Tai Kedong等[14]的研究结论一致。比较PNLs-Cur和NLs-Cur对保留率，说明PSP的存在显著（P＜0.05）延长了姜黄素在高温条件下的降解数量，PNLs-Cur表现出更好的热稳定性。

2.6 体外释放实验结果

图6 NLs-Cur和PNLs-Cur 的体外释放曲线Fig. 6 In vitro release curves of NLs-Cur and PNLs-Cur

通过对NLs-Cur体外释放行为的研究对其体内性能具有重要的意义，有助于评价姜黄素的缓释行为[15]。如图6所示，NLs-Cur与PNLs-Cur初始释放较快，随后释放减缓，这与Yingyuad等[41]研究结果相似。PNLs-Cur在72 h的累计释放率为50.08%，而NLs-Cur为63.64%。Kaddah等[42]发现，加入胆固醇后，罗丹明B的释放量显著下降。Tai Kedong等[14]报道了添加β-谷甾醇显著降低了姜黄素在纳米脂质体中的累计释放速率，并且随着β-谷甾醇的增加，累计释放速率随之降低。这说明PSP的存在可以显著（P＜0.05）减缓NLs-Cur的释放速率，其原因可能是PSP与磷脂的相互作用使得脂质体的双层膜更加致密，从而降低姜黄素的渗透率。

3 结 论

本实验利用PSP替代胆固醇修饰NLs-Cur，以提高其理化稳定性和姜黄素的缓释性。通过对粒径、电位等指标的考察，发现PSP可使NLs-Cur粒径显著增大，当磷脂与PSP的比例为8∶1时，其制备PNLs-Cur的平均粒径为（83.76±1.29）nm，Zeta电位为（－11.0±1.06）mV，PDI为0.30±0.002，各项指标较为理想；稳定性实验表明，相同条件下发现PNLs-Cur的不稳定性指数更小，即PSP可改善NLs-Cur的离子和pH值稳定性。此外，PNLs-Cur具有更好的热稳定性，80 ℃处理60 min后姜黄素的保留率更高。体外释放结果表明，PSP可以显著提高NLs-Cur的缓释特性。因此，本研究可为采用PSP代替胆固醇，制备更 加稳定的无胆固醇脂质体载体提供一定的理论指导，对火龙果茎副产物的综合利用具有一定的应用启发。