趋化因子受体CCR9及其配体CCL25在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义*

李伟，左楠，刘文辉，胡腾龙

150001哈尔滨, 哈尔滨医科大学口腔医学院 口腔颌面外科

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是颌面部最常见的恶性肿瘤，每年约有500 000例新发病例[1]。在过去几年中，虽然OSCC的临床治疗方法不断改进，但5年总生存率仅从63%增加到65%，并未显著改善[2]。因此，探索肿瘤细胞发生、发展、迁移和侵袭的生物学机制，仍是预防和治疗OSCC的关键所在。

趋化因子及其受体与肿瘤细胞的发生、发展及肿瘤的特异性转移密切相关，在许多肿瘤疾病中出现表达增高的现象[3]。趋化因子受体与配体相互结合引起肿瘤细胞归巢到转移灶或抑制免疫细胞的募集，导致肿瘤发生发展，从而最终导致患者死亡[4]。本研究采用免疫组化法评估趋化因子受体CCR9及其配体CCL25在OSCC组织及正常口腔粘膜组织中的表达，并进一步分析其表达与OSCC临床病理因素之间的相关性以及二者之间的相关性,以期为OSCC的病因学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选取2016年至2019年就诊于哈尔滨医科大学附属口腔医院的初发口腔鳞癌患者的石蜡标本68例，所有患者均行手术治疗，术前均未经其他治疗，标本经病理证实。男性患者25例，女性患者43例，年龄为17～88岁；肿瘤直径>4 cm 26例，≤4 cm 42例；组织病理分级(参考WHO 分级标准)：高分化44例，中低等分化24例；TNM分期(参考国际抗癌联盟第六版)T1～T2 期20例，T3～T4期48例；淋巴结转移22例，无淋巴结转移46例。选取30例正常口腔黏膜(normal oral mucosa,NOM)组织作为对照组。所有病例临床资料完整。

1.2 主要试剂

兔抗人多克隆CCR9抗体(14076R)购于美国Abcam公司。兔抗人多克隆CCL25抗体(25285-1-AP)购于武汉三鹰有限公司。免疫组化S-P试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法

组织标本经常规石蜡包埋，4 μm连续切片，常规HE染色观察并确认病理学分型；免疫组织化学S-P法染色，操作步骤按S-P试剂盒说明书进行，组织蜡片标本脱蜡水化，枸橼酸抗原修复，3%去离子水封闭内源性过氧化物酶，1∶300稀释的CCR9和CCL25一抗孵育过夜；次日加入生物标记二抗，DAB试剂盒显色，苏木素复染，封片。以磷酸缓冲盐溶液代替一抗作为阴性对照，以已知OSCC切片为阳性对照。

1.4 结果判定

所有切片均由两名病理科医师以双盲法进行独立评估。CCR9蛋白及CCL25蛋白的阳性着色主要表达于细胞质，以细胞质出现棕褐色或棕黄色颗粒作为判定标准，半定量积分法结果评价。阳性细胞百分比分级评分：每张切片随机选取5个不重叠的肿瘤组织区域，高倍镜下(×400)观察并计数每100个细胞中癌细胞的数量，计算其所占百分比，累计每个视野的百分比加权平均值作为判定结果计分：阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，阴性则为0分。按染色强度分级计分：无着色为0，浅黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3。将两分级乘积作为总积分，得分0～1分为(-)，2～3分为(±)，4～5 分为(+)，≥6分为(++)。本实验以(++)定义为阳性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件，χ2检验分析CCR9和CCL25的表达及其与OSCC临床病理特征之间的关系。Pearson列联系数分析OSCC中CCR9和CCL25表达的相关性。以P<0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 OSCC组织和NOM组织中CCR9和CCL25表达的比较

CCR9和CCL25的阳性表达主要定位于细胞质中(图1)。CCR9在OSCC中的阳性表达率(61.8%)显著高于对照组NOM(33.3%)，具有统计学意义(P<0.05)(表1、图1A、图1B)。CCL25在OSCC中的阳性表达率为58.8%明显高于NOM中的26.7%，差异有统计学意义(P<0.05)(表1、图1C、图1D)。

2.2 CCR9和CCL25的表达与OSCC患者临床病理特征之间的关系

如表2所示，CCR9在OSCC中的表达与OSCC的分化程度(χ2=9.399，P<0.05)、TNM分期(χ2=12.341，P<0.05)、淋巴结转移(χ2=8.888，P<0.05)之间有显著相关性(P<0.05)，但与患者的性别、年龄、肿瘤大小的相关性无统计学意义(P>0.05)。CCL25在OSCC中的表达与OSCC的分化程度(χ2=6.337，P<0.05)、TNM分期(χ2=7.572，P<0.05)、有无淋巴结转移(χ2=6.852，P<0.05)之间有显著相关性(P<0.05)，但与患者的性别、年龄、肿瘤大小的无显著相关性(P>0.05)。

图1 CCR9和CCL25在OSCC和NOM组织中的表达

OSCC: Oral Squamous Cell Carcinoma; NOM: Normal oral mucosa.

表1 CCR9和CCL25蛋白的表达情况

表2 CCR9和CCL25的表达与口腔鳞癌患者临床病理特征的关系

2.3 OSCC组织中CCR9和CCL25表达的相关性

68例OSCC中，CCR9和CCL25同时表达阳性的有34例，同时表达阴性的20例。OSCC组织中CCR9和CCL25的表达呈正相关(r=0.571，P<0.05)(图2)。

图2 OSCC组织中CCR9和CCL25表达的相关性

3 讨 论

CC族趋化因子配体CCL25通过特异性结合的方式定位于细胞表面，与其受体CCR9相互作用，参与调节机体系统的稳定等过程[5-6]。趋化因子及其配体不仅可以聚集多种免疫相关细胞到肿瘤微环境中，还可以介导癌细胞的归巢效应[7]。CCR9和CCL25结合可使癌细胞中的抗凋亡蛋白PI3K、AKT、ERK1/2和GSK-3β等表达上调，同时下调caspase-3，从而参与肿瘤的发生发展[8]。CCR9及其配体CCL25与多种恶性肿瘤密切相关, 但在OSCC中的表达研究目前鲜见报道[9]。因而探讨CCR9和CCL25在OSCC的发生发展过程中的作用，及其与口腔鳞癌患者临床病理特征之间的关系对预防和治疗OSCC具有重要意义。

大量研究发现趋化因子受体与其配体参与肿瘤细胞各种生理、病理过程，如黏附、增殖、抗凋亡及血管生成等[10]。相关的临床病理研究表明：卵巢癌[11]、胰腺癌[12]、结肠癌[13]、前列腺癌[14]、乳腺癌[15]等肿瘤细胞中CCR9及其配体CCL25的表达与肿瘤侵袭和淋巴结转移之间显著相关。马水根等[16]研究发现CCR9和CCL25在上皮性卵巢癌中高表达，与淋巴结转移、组织学分级和临床分期有显著相关。Heinrich等[17]人发现CCR9和CCL25在胰腺癌中高表达，通过自分泌和旁分泌途径增强胰腺癌的侵袭能力。本研究数据显示，在OSCC中CCR9与CCL25阳性表达率分别为61.8%(42/68)、58.8%(40/68)，均高于正常口腔粘膜组织中的33.3%(10/30)与26.7%(8/30)，差异具有统计学意义(P<0.05)。通过对CCR9和CCL25与OSCC临床病理之间的关系行进一步研究，结果显示两者的表达与其TNM分期、分化程度及淋巴结转移的相关性亦有统计学意义(P<0.05)，而与患者的年龄、性别及肿瘤直径的大小无关(P>0.05)。由此我们高度怀疑OSCC的发生发展、侵袭及远处转移可能与CCR9和CCL25的过表达有关。CC族趋化因子受体不仅在机体淋巴细胞免疫渗出调节过程中影响淋巴器官迁移的能力，同时调节白细胞的趋化、造血干细胞的增殖等机体内一系列机体免疫调控过程。因此，CCR9及CCL25的表达似乎可以反应患者机体的免疫状态，作为判断OSCC治疗后机体免疫应答能力的指标，有望用于对OSCC的诊断和预后进行评估。

Vicari等[18]在人和小鼠的胸腺中首次发现CCL25与其特异性受体CCR9相互作用后，能促进T细胞的增殖。CCR9与CCL25作用后可能会募集 CCR9阳性表达的T细胞作为“归巢受体”，通过增强细胞的运动性使口腔鳞癌细胞转移到其他组织中来发挥重要的调节作用。在前列腺癌的研究中，阻断CCR9-CCL25轴相互作用从而抑制前列腺癌细胞抵抗凋亡，可以显著降低前列腺癌细胞的侵袭与迁移能力[19]。相关动物实验研发现鼠抗人CCR9单克隆抗体可以促进急性T淋巴细胞白血病肿瘤细胞的凋亡，使血管生成下降，通过补体和细胞依赖性细胞毒作用杀死肿瘤细胞[20]。Li等[21]在非小细胞肺癌组织中发现CCR9与CCL25之间相互作用可以激活CD4+ T淋巴细胞相关酶，介导PI3K/Akt途径的激活，从而导致抗凋亡蛋白的上调以及PI3K-/Akt-依赖性细胞凋亡蛋白的下调。CCR9-CCL25轴活化PI3K /Akt 途径增加核转录因子κB的转录活性，上调MMP-2的表达，阻断细胞的凋亡，同样证实了趋化因子及其配体在癌细胞的侵袭和转移中起重要作用[22]。本研究数据显示出CCR9和CCL25在OSCC中过表达具有相关性，由此，我们推测在OSCC的发生发展过程中，若能够阻断CCR9-CCL25轴相互作用，可能会有效抑制口腔鳞状癌细胞抵抗凋亡的能力，加速肿瘤细胞死亡，从而达到抑制鳞癌细胞增殖或远处转移的目的。

综上所述，本研究表明趋化因子受体CCR9及其配体CCL25与OSCC的发生、发展、转移密切相关。通过沉默CCR9和CCL25的表达，有望作为OSCC靶向治疗的标靶。但关于CCR9和CCL25在OSCC中的具体作用及调控机制尚还需进一步深化研究和探讨。

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