基于KEGG的碳固定和氮代谢通路土壤微生物组筛选

王小利 王淑兰

(西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100)

0 引言

施肥、耕作和秸秆还田是影响土壤微生物数量、群落结构及其功能的主要农业措施，也是实现农田可持续生产的有效措施[1-3]。渭北旱塬地处我国北方半湿润易旱和偏旱气候区，耕地面积75%以上为旱作粮田，长期实行“小麦-夏闲”耕作制。根据陕西省农业厅对旱作冬小麦和春玉米平衡施肥推荐方案与渭北旱作高产冬小麦和春玉米常规施肥调查结果，从2007年开始本课题组在渭北旱塬开展了秸秆还田条件下小麦连作粮田的长期定位施肥试验，设立了常规施肥(SC)、平衡施肥(SB)和低量施肥(SL)3种施肥方式，改进和完善了旱作粮田作物栽培和土壤耕作机制，在蓄水保墒、水土保持、抗旱增产、有机碳积累、微生物多样性等方面进行了一系列研究[4-7]。但针对长期秸秆还田条件下旱地小麦连作粮田在不同施肥水平下土壤微生物功能的响应机制研究还处于起步阶段。碳固定、氮代谢是农田生态系统中微生物最活跃的2个能量代谢途径，研究表明，化肥会影响秸秆的分解及土壤碳和氮的转化过程[8-10]。因此，利用长期定位试验注释小麦连作粮田土壤碳、氮代谢微生物的功能基因对长期施肥的响应，对探究碳固定、氮代谢通路的分子机制和旱地粮田固碳减排机理具有重要意义。

微生物宏基因组学是由大规模海量测序转向功能导向的微生物组学研究，基于大规模宏基因组鸟枪法测序和宏基因组序列拼接，并通过与已知基因序列数据库相似性的比对进行微生物分类和功能的注释[11-12]。在KEGG数据库，将行使相同功能的基因聚在一起，称为KEGG ortholog groups (KO)，每个KO包含多个基因信息，并在一至多个代谢通路中发挥作用，能够大幅减小测序数据量以及数据分析的工作量，且可用来直接鉴定农田生态系统的特定代谢途径微生物群落的基因数量[13-15]。本文利用宏基因组测序技术，以KEGG数据库碳固定、氮代谢2个能量代谢途径(map00720、map00910)为研究工具，以陕西渭北旱塬小麦连作粮田深松和秸秆还田的长期定位试验为基础，以常规施肥(SC)、平衡施肥(SB)和低量施肥(SL)3种施肥土壤为研究对象，对影响其农田生态系统中碳固定、氮代谢相关的物种及功能基因进行筛选，分析微生物物种与功能的关系及其对长期施肥的响应，为探讨该地区小麦粮田土壤微生物的碳固定、氮代谢机理及区域粮田可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

陕西省合阳县甘井镇西北农林科技大学旱农试验站(35°19′54.45″N, 110°5′58.35″E)位于渭北旱塬东部,海拔877 m,属典型的黄土高原沟壑区,暖温带半干旱型大陆性季风气候,多年平均降雨量为536.6 mm, 主要集中在7—9月。土壤为黑垆土。

长期定位施肥和耕作试验于2007年9月—2016年6月实施，品种为长旱58。试验小区有3个，每个小区面积110 m2(22 m×5 m)。前茬小麦收获时秸秆高留茬20～30 cm覆盖地表，每间隔40～60 cm宽度留茬深松35～40 cm，夏闲期喷洒除草剂防除杂草。在休闲期满后作物播种时，采用3种施肥方式：①平衡施肥(SB)：N施肥量150 kg/hm2，P2O5施肥量120 kg/hm2，K2O施肥量90 kg/hm2。②常规施肥(SC)：N施肥量255 kg/hm2，P2O5施肥量90 kg/hm2。③低量施肥(SL)：N施肥量75 kg/hm2，P2O5施肥量60 kg/hm2，K2O施肥量45 kg/hm2。氮、磷、钾肥分别以尿素、磷酸二铵和硫酸钾的形式定位施入。田间管理按照本地高产田措施进行良好管理。在2016年6月小麦收获后采集10～20 cm表层土壤样品，每个小区3个重复，每个重复选3个点采样混合过筛，于田间放入液氮罐中，到室内保存于-80℃超低温冰箱中，用于土壤微生物宏基因组测序。2007—2016年各处理平均小麦产量：低量施肥为3 405.7 kg/hm2，常规施肥为3 953.2 kg/hm2，平衡施肥4 194.7 kg/hm2。2016年6月小麦收获后10～20 cm土层养分情况如表1所示。

表1 10～20 cm土层养分情况Tab.1 Nutrient status of 10～20 cm soil layer

1.2 DNA提取、文库构建及测序

采用 CTAB 法对样本的基因组DNA进行提取，琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性；检测合格的DNA样品用超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR(聚合酶链式反应)扩增等步骤完成整个文库制备。库检合格后，把不同文库按照有效浓度混合后进行Illumina HiSeq测序[16-19]。

1.3 信息分析

1.3.1数据质控

首先对原始数据进行质控及宿主过滤，然后进行宏基因组(metagenome)组装，并采用MetaGeneMark软件进行基因预测，构建基因目录，获得各样品中的丰度信息[16-17]。

1.3.2物种及功能基因注释

从基因目录出发，与MicroNR库进行比对，获得每个基因的物种注释信息，并结合基因丰度，获得不同分类层级的物种丰度；从基因目录出发，进行碳固定、氮代谢通路(map00720、map00910)的功能注释和丰度分析[18-19]。

1.3.3代谢通路分析

基于功能丰度，进行丰度聚类分析，对代谢通路进行比较分析，分析处理之间的功能组成差异及其与物种的相关性[20-23]。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物功能基因比较分析

质控后总测序数据量为124 651.25 Mbp，组装得到4 250 132 693 bp的Scaffolds，预测得到7 682 452条ORFs，经去冗余后得到4 588 922条ORFs。其中有1 344 013 (29.29%)个基因能够比对上KEGG数据库，有706 049(15.39%)个基因能够比对上数据库中的5 734个KEGG KO。对3个施肥水平土壤微生物KEGG数据库第3水平的所有代谢通路的功能基因进行PcoA分析(主坐标分析)，基于功能基因丰度表得到Bray-Curtis距离矩阵，样品距离越接近，表示功能基因组成越相似，功能基因结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，功能基因差异大的样品则会远远分开。从图1可以看出施肥对KEGG数据库检测到的代谢通路有明显的影响，表现为SC与SB的土壤功能基因组成相似度高，而与SL相似度较低。

图1 KEGG第3水平的PcoA分析Fig.1 PcoA analysis at Level 3

2.2 碳固定途径功能基因分析

2.2.1施肥方式对碳固定途径功能基因的影响

通过与KEGG途径中的碳固定通路比对，发现检测到功能基因48个，而且3种施肥方式土壤检测到的功能基因相同(图2红色框内表示3种施肥方式检测到的基因)。

图2 3种施肥方式的碳固定途径检测到的基因Fig.2 Gene detected by carbon fixation pathway of three fertilization methods

通过3种施肥方式的碳固定途径的主要功能基因(丰度排名前十)比较(图3)发现， SC(相对丰度累加值为1.65×10-3)的主要功能基因相对丰度累加大于SB(1.55×10-3)，SB的主要功能基因相对丰度累加大于SL(1.10×10-3)，说明施肥明显改变了碳固定的主要功能基因丰度。

图3 碳固定途径的主要功能基因比较Fig.3 Comparison of major functional genes in carbon fixation pathway

2.2.2碳固定途径物种与功能基因相关分析

通过基因目录与MicroNR库比对，利用属水平的物种与碳固定途径的主要基因进行相关分析，选择相关系数大于0.8和小于-0.8的物种33个属，发现有24个属与碳固定的基因有0.05水平显著相关关系(图4)。进一步研究发现其中13个物种(Sorangium、Spiribacter、Lentzea、Rhodovibrio、Pseudomonas、Flavihumibacter、Streptomyces、Nitrososphaera、Rubrobacter、Dyadobacter、Novosphingobium、Pedosphaera、Thermogemmatispora)与28个功能基因有0.01水平的极显著差异。这13个物种是这一地区小麦连作土壤微生物碳固定途径的标记性微生物种群。在这28个基因中，与5个以上属有极显著性差异的基因有14个:E4.2.1.2A.fumA.fumB、E2.3.1.9.atoB、mdh、ACSS.acs、korB.oorB.oforB、pps.ppsA、ppdK、sdhA.frdA、K18594、K18604、E4.2.1.2B.fumC、folD、ppc、accA，为小麦连作粮田土壤微生物碳固定途径的标记性基因。

图4 碳固定途径的物种(属)与基因相关分析Fig.4 Analysis of species (genus) and gene correlation of carbon fixation pathway

2.3 氮代谢途径功能基因分析

2.3.1施肥方式对氮代谢途径功能基因的影响

通过与KEGG途径中的氮代谢通路比对，发现检测到基因46个，且检测到的3种施肥方式基因数目相同(图5红色框内表示3种施肥方式检测到的基因)。

图5 3种施肥方式的氮代谢通路Fig.5 Nitrogen metabolism pathways of three fertilization methods

通过3种施肥方式的氮代谢途径的主要功能基因(丰度排名前十)比较发现(图6)，SB(相对丰度累加值为1.10×10-3)的主要功能基因相对丰度累加大于SC(1.00×10-3)，SC的主要功能基因相对丰度累加明显大于SL(6.50×10-4)，说明施肥明显改变了氮代谢的主要功能基因丰度。

图6 氮代谢途径主要功能基因比较Fig.6 Comparison of major functional genes in nitrogen metabolism pathway

2.3.2氮代谢途径物种与功能基因相关分析

通过基因目录与MicroNR库比对，利用物种与氮代谢途径基因进行相关分析，选择相关系数大于0.8和小于-0.8的13个属的物种，与氮代谢途径的主要基因进行相关分析(图7)，筛选出代表性的物种和基因。具有0.01极显著相关的物种有7个：Sphingopyxis、Alcanivorax、Nitrosospira、Aeromicrobium、Roseiflexus、Devosia、Altererythrobacter。具有极显著的基因有12个，其中与4个以上物种显著相关的功能基因有5个：nirB、 nasA、 nasB、 nrt.nak.nrtP.nasA、 GDH2。

图7 氮代谢途径的响应物种与基因相关分析Fig.7 Correlation analysis of species and genes in response to nitrogen metabolism pathway

3 讨论

3.1 碳固定和氮代谢途径功能微生物筛选

本研究发现旱地麦田在深松+秸秆还田的条件下，施用化肥明显改变了土壤碳固定和氮代谢途径的物种及功能基因丰度。常规施肥和平衡施肥的主要功能基因丰度均大于低量施肥；在碳固定途径中常规施肥主要功能基因丰度大于平衡施肥，在氮代谢途径中平衡施肥主要功能基因丰度均大于常规施肥。这说明常规施肥对碳固定的作用更大一些，平衡施肥则更利于氮代谢。同时通过功能微生物的筛选，没有筛选到碳固定和氮代谢协同的微生物，说明在秸秆还田和深松的小麦连作农田生态系统中微生物物种是分工协作的，碳固定和氮代谢分别有各自特有的主要物种。因此可以利用筛选到的物种进行土壤微生物多样性研究的标记物种；也可以通过功能基因作标记来检测渭北旱塬农田土壤微生物基因丰度及其对环境因子的响应，为进一步研究这一地区的土壤微生物组提供了便利条件。

3.2 施肥对土壤微生物碳固定的影响

本文是在深松+秸秆还田的保护性耕作情况下进行不同施肥水平试验，土壤微生物固碳途径物种和功能基因丰度的变化是耕作、施肥和秸秆还田共同作用的结果。秸秆还田为微生物的生长繁殖提供了大量的碳源和能源，小麦根系分泌物也会影响微生物的组成及数量，进而影响土壤碳固定活性；化肥的施用能够直接改变土壤中有机碳的结构与含量，显著增加或抑制土壤微生物的增殖。化肥的合理施用能够改变土壤中有机碳的含量，增加固碳微生物的繁殖；在贫瘠的土壤施用化肥，土壤中有机碳含量受限会促进微生物分泌更多的胞外酶，从而加速土壤有机质的分解，增加土壤碳固定；反之，肥沃的土壤不合理地大量施肥，微生物活性降低、数量减少，同时小麦产生胞外酶也减少，抑制有机碳的分解，反而降低土壤碳固定活性[24-26]。所以氮肥优化管理措施可以通过提高作物产量，增加作物根系分泌物量及秸秆产量，促进土壤碳库积累。本研究发现在秸秆还田和深松耕作条件下，碳固定途径中平衡施肥和常规施肥都增加了基因丰度，而且常规施肥的碳固定功能基因响应略大于平衡施肥，说明常规施肥在当地小麦生产中有一定的利用价值，还没有达到抑制碳固定的程度，在秸秆还田下化肥使用量对碳固定的阈值，还需要进一步研究。

3.3 施肥对土壤微生物氮代谢的影响

土壤环境中氮的浓度和形态发生变化会导致土壤微生物氮代谢通路改变，土壤微生物对氮素营养的吸收利用机制及分子层面的响应表现出不同的生理活动和生长状况，以更好地适应环境[27]。本研究发现在秸秆还田和深松耕作条件下氮代谢途径中，以平衡施肥功能基因丰度最大，常规施肥次之，低肥处理最低。而2007—2016年9年平均小麦产量低量施肥处理为3 405.7 kg/km2，常规施肥为3 953.2 kg/km2，平衡施肥4 194.7 kg/km2，即平衡施肥大于常规施肥，常规施肥大于低量施肥，说明小麦产量与土壤微生物氮代谢功能基因有一定的协同性；但化肥使用量与氮固定基因丰度、产量并没有一致性的响应。所以常规施肥量不仅不利于土壤氮代谢微生物氮代谢通路功能基因丰度的增加，也不能带来更高的小麦产量，不利于土壤的可持续利用。同时，化肥施用也是影响土壤N2O排放最重要的因素，因为其可以直接为硝化和反硝化微生物提供作用底物[28-29]。所以，在本试验中，平衡施肥是该地区比较合理的施肥方式，有利于维持小麦产量、土壤氮代谢活力以及温室气体排放的平衡，对土壤可持续利用和节肥减排具有一定的指导意义。

4 结束语

常规施肥与平衡施肥处理的麦田土壤微生物功能基因丰度关系密切，而与低量施肥处理关系较远。施肥明显改变了碳固定、氮代谢功能基因丰度，常规施肥和平衡施肥的主要功能基因丰度均大于低量施肥；在碳固定途径中常规施肥主要功能基因丰度大于平衡施肥，在氮代谢途径中平衡施肥主要功能基因丰度大于常规施肥。筛选得到碳固定途径微生物13个属，与之紧密相关的功能基因14个；筛选得到氮代谢途径微生物7个属，与之紧密相关的功能基因5个。平衡施肥更有益于节肥减排和土壤的可持续利用，是适合该地区小麦连作粮田的施肥方式。