硫化物胁迫对刺参(Apostichopus japonicus)幼参的急性毒性效应及抗氧化防御系统的影响

王昕宇,陶文卿,吕慧超,李秉钧,赵 业

(烟台大学海洋学院,山东 烟台 264005)

刺参(Apostichopusjaponicus)隶属于棘皮动物门(Echinodermata),海参纲(Holothuuroidea),楯手目(Aspidochirota),刺参科(Stichopodidae)[1]．刺参营底栖生活,加之行动迟缓,因而十分容易受到底质中氨氮和硫化物等有害物质的胁迫[2]．硫化物广泛存在于自然水体和养殖水体及其沉淀物和底泥中,主要存在形式包括H2S、HS-和S2-．在实际的养殖生产中,硫化物很难被准确测量,但其对水生动物的养殖却时刻存在着重大威胁[3]．硫化物对水生生物的毒性主要表现在抑制有氧呼吸、降低免疫力、影响摄食等[4]．硫化物胁迫也会造成动物体内活性氧增加,并引起其抗氧化能力的改变[5]．动物体通过体内的抗氧化防御系统清除体内多余的活性氧．目前,有关硫化物对水生生物的毒性研究主要集中在鱼类、虾类、单环刺螠等物种上[6-8],对棘皮动物尤其是刺参的毒性及其抗氧化防御机制影响的研究鲜有报道．

本研究以刺参幼参为研究对象,通过为期4 d的急性硫化物胁迫对刺参幼参的急性毒性实验,得出半致死浓度和安全浓度,并测定在2个亚致死浓度硫化物胁迫下刺参幼参肠道组织中主要抗氧化防御酶活性的变化,旨在探讨其对硫化物的耐受力和抗氧化防御系统的适应,为刺参养殖水体环境的有效调控和刺参健康养殖提供参考．

1 材料与方法

1.1 供试动物

试验刺参幼参平均体质量5.00±0.24 g,平均体长5.00±0.50 cm,选自刺参幼参购于烟台东方海洋科技股份有限公司,为人工繁殖饲养5个月龄的幼参．幼参在室内50 L塑料箱内暂养7 d,暂养期间日换水1次,隔日投喂饵料1次．试验开始1 d前停止投喂饵料,随机分组用于试验．试验海水取自烟台近海,砂滤除杂质,pH值为7.51,溶氧量为7.64 mg/L,盐度为31.83,置于消毒玻璃缸中待用．

1.2 试验设计

1.2.1 急性毒性试验 参照《水生生物检测手册》中静水毒性试验法[9],先根据预实验结果确定出硫化物的试验浓度范围,由预实验所得浓度范围依据等对数间距法计算,设置刺参幼参急性实验的质量浓度(0、2、2.378、2.828、3.363、4 mg/L)，每种浓度设置3个平行．硫化物以母液(10 mmol/L Na2S·9H2O, 1 mol/L HCl调pH值至6.9)的形式加入各实验组水体中．

在室温下采取静水试验法,每个2 L烧杯中放入12头刺参,烧杯密封,试验期间,不投喂不充气,保持水温为16.5±1.5 ℃,每隔2 h(根据硫化物浓度变化实验可知硫化物在2 h内,浓度变化不大[8])补充1次硫化物(添加值由初始浓度和实测浓度的差值算得),维持硫化物浓度为原始预设浓度,每隔24 h全量换水1次．本实验中采取的硫化物测定方法是亚甲基蓝分光光度法,此方法检出限为2.5 μmol/L[10]．试验期间,每隔4 h观察一次幼参状态,并记录挂壁个数和死亡个数,幼参死亡的判定以沉入烧杯底部、管足无吸附能力、对轻微刺激无反应、放入自然海水不能复活为准[11],及时清除死亡个体,保证水质免受污染．

各试验组取3个平行组的平均值计算死亡率和附壁率．附壁率(RA)是用来评价幼参附着能力和活动情况的参数,按公式RA=100%×NA/12计算,式中NA为附着在烧杯壁上的幼参数．采用SPSS 20.0软件Probit回归分析,用概率单位法做出浓度对数-概率单位线性方程,并计算出硫化物对刺参的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度(LC50)及95%置信区间．安全浓度(SC)计算公式:SC=96 hLC50×0.1[12]．

1.2.2 亚致死毒性试验 根据预实验结果,设0.8 mg/L(低浓度组)和1.6 mg/L(高浓度组)2个硫化物组,以自然海水为空白对照组,每个实验组设2个平行．在每个25 L圆柱形塑料桶中放入30头刺参,试验期间密封,不充气,每隔24 h投饵．根据预实验硫化物浓度变化,为维持各实验组硫化物初始浓度,每隔2 h添加硫化物母液1次．每隔24 h全量换水1次．试验开始后的第24、48、72、96小时进行取样．每次从每个平行中随机选取5头刺参作为样本．取样后用0.9%的生理盐水冲洗刺参体表,用灭菌后的滤纸吸干体表水分,在灭菌的冰培养皿上迅速解剖刺参．取肠道置入冻存管中放入液氮中暂存．

1.2.3 酶活性测定 取0.1 g刺参肠道组织,加入1 mL的匀浆介质(0.01 mol/L Tris, 0.1 mmol/L EDTA-2Na, 0.01 mol/L 蔗糖,0.8% NaCl, pH值调至7.4)．冰浴条件下,匀浆机充分匀浆后,4 ℃、1 000 r/min离心20 min．取上清液至于-20 ℃保存备用．

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、总谷胱肝肽(GSSG+GSH)和总蛋白含量采用碧云天生物技术有限公司的试剂盒进行测定．SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法,在黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时,反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位;CAT活力单位定义为:在25 ℃,pH 7.0条件下,在1 min内催化分解1 μmol H2O2所需CAT的量定义为一个酶活力单位(U)．SOD和CAT的活性单位为U/mg．T-AOC测定结果用mmol/g表示．GSSG+GSH含量测定结果用nmol/mg表示．

2 结 果

2.1 硫化物对刺参幼参的急性毒性致死效应

2.1.1 硫化物对刺参幼参死亡率的影响 硫化物对刺参幼参的急性致死效应如图1所示,结果表明对照组无一个体死亡,而各硫化物胁迫实验组个体均有不同程度的死亡,且死亡率随着硫化物浓度和胁迫时间的增加而不断升高．各时间段浓度对数与概率单位的回归方程如表1所示,通过实验数据计算出硫化物胁迫下刺参幼参的LC50及相应95%置信区间．刺参幼体在硫化物中暴露的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为4.397、3.769、3.001、2.678 mg/L,SC为 0.267 8 mg/L．

2.1.2 硫化物对刺参幼参附壁率的影响 如图2所示,在硫化物暴露下刺参幼参的附壁率随硫化物处理时间和硫化物浓度的增加而降低．试验期间,对照组刺参幼参的附壁率为100%．高浓度硫化物在短时间虽未造成刺参大规模死亡,但附壁率几乎为0．这说明高浓度硫化物会极大抑制刺参活力．

2.1.3 硫化物对刺参幼参状态的影响 在低浓度的硫化物暴露下,少量刺参从瓶壁上脱落至瓶底．随着暴露时间和硫化物浓度的增加,刺参开始出现口器张开、摇头晃尾甚至局部肿胀．随着硫化物浓度继续升高,刺参出现吐肠、化皮现象乃至死亡(图3)．

表1 硫化物对刺参幼参急性毒性作用及安全浓度分析

2.2 硫化物对刺参幼参肠道组织抗氧化防御系统的影响

2.2.1 刺参肠道总抗氧化能力变化 刺参肠道总抗氧化能力T-AOC变化趋势如图4(a)所示,在硫化物暴露下,低浓度组T-AOC略高于对照组,与对照组差异性不大．硫化物暴露至24 h时,高浓度硫化物处理组T-AOC显著高于对照组(P<0.05),是对照组的1.43倍．硫化物暴露至48 h,高浓度硫化物处理组T-AOC下降至对照组的1.15倍,与对照组差异不明显．硫化物暴露至72 h,高浓度硫化物处理组略低于对照组,差异不明显．硫化物暴露至96 h时,高浓度硫化物处理组 T-AOC显著低于对照组(P<0.05),下降至对照组的82%．

2.2.2 刺参肠道超氧化物歧化酶活性变化 刺参肠道超氧化物歧化酶SOD活性变化趋势如图4(b)所示,硫化物暴露24 h时,低浓度硫化物处理组和高浓度硫化物处理组SOD活性稍高于对照组,差异不显著．硫化物暴露至48 h时,低浓度硫化物处理组SOD活性显著高于对照组(P<0.05),为对照组的1.2倍．硫化物暴露至72 h时,低浓度硫化物处理组和高浓度硫化物处理组均显著高于对照组(P<0.05),约为对照组的1.21倍．硫化物暴露72 h至96 h,低浓度硫化物处理组和高浓度硫化物处理组SOD活性变化不大,均约为对照组的1.2倍．

2.2.3 刺参肠道过氧化氢酶活性变化 刺参肠道过氧化氢酶活性变化趋势如图4(c)所示,在硫化物暴露24 h至96 h,低浓度硫化物处理组和高浓度硫化物处理组CAT活性随时间不断上升．其中,硫化物暴露24 h时,低浓度硫化物处理组和高浓度硫化物处理组CAT活性均稍高于对照组,差异不显著．硫化物暴露至48 h,高浓度硫化物处理组CAT活性显著高于对照组(P<0.05),为对照组的1.19倍．硫化物暴露至72 h,低浓度硫化物处理组和高浓度硫化物处理组CAT活性均显著高于对照组(P<0.05),分别为对照组的1.19倍和1.28倍．硫化物暴露至96 h时,低浓度硫化物处理组和高浓度硫化物处理组均约为对照组的1.29倍,差异显著(P<0.05)．

2.2.4 刺参肠道总谷胱肝肽含量变化 刺参肠道总谷胱甘肽GSSG+GSH含量变化趋势如图4(d)所示,高浓度硫化物处理组总谷胱甘肽含量在24 h至96 h间持续上升．其中暴露24 h、48 h、72 h和96 h时,高浓度组总谷胱甘肽含量均显著高于对照组(P<0.05),分别为对照组1.8、2.2、2.8和3倍．低浓度组总谷胱甘肽含量在2 h至96 h间也持续上升,上升趋势比高浓度组缓慢．其中,硫化物暴露24 h和48 h时,低浓度组总谷胱甘肽含量稍高于对照组,差异不明显．在硫化物暴露72 h和96 h,低浓度组总谷胱甘肽含量显著高于对照组(P<0.05),分别为对照组的1.4倍和1.7倍．

3 讨 论

3.1 硫化物对刺参幼参的急性毒性

硫化物的危害一方面表现为硫化氢具有强烈的毒性,另一方面硫化物耗氧力强,容易导致水体缺氧．国家海水水质标准规定海水硫化物 (以S计)浓度应小于0.05 mg/L才达到对海洋生物幼体安全的浓度．然而,硫化物对不同种类生物的毒性效应差异较大,如对罗氏沼虾幼虾Macrobrachiumrosenbergii96 hLC50为2.57～4.20 mg/L[6];对北美底鳉Fundulusparvipinnis96 hLC50为22.4 mg/L[7];对30～50 mm的紫贻贝Mytilusedulis96 hLC50为 50 mg/L[13];对中华绒毛蟹Eriocheirsinensis96 hLC50为3.09 mg/L[4];对日本沼虾Macrobrachiumnipponense96 hLC50为11.35 mg/L[5]．本试验刺参对硫化物96 hLC50为2.678 mg/L,表明刺参与其他水生生物相比,其对硫化物的耐受力比较弱．硫化物对刺参幼参的SC为0.267 8 mg/L,因此建议生产上应密切监测养殖水质,控制硫化物低于该数值．本研究中,刺参在硫化物急性暴露下出现附着力下降并出现排脏,说明硫化物对刺参的毒性较强,短时间的硫化物处理已诱发刺参的应激反应．

3.2 硫化物对刺参肠道组织抗氧化防御系统的影响

T-AOC是近年研究发现用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合指标,它的大小可代表和反映机体抗氧化防御系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态[14]．本研究表明,低浓度硫化物组刺参幼参肠道T-AOC随时间延长略有升高;高浓度组T-AOC在24 h时高于对照组,至48 h高浓度组T-AOC随时间的延长而降低,96 h时显著低于对照组．这与硫化物对日本沼虾的胁迫实验中[5],低浓度组和高浓度组沼虾在胁迫试验前期T-AOC升高,高浓度组在12 h后T-AOC随暴露时间的延长而降低的结果一致．这可能是由于硫化物对刺参的胁迫作用导致个体内的活性氧含量增加,刺激了各种抗氧化酶活性的升高,从而提高了T-AOC．

SOD是广泛存在于各种生物体中的抗氧化酶,它能够催化超氧阴离子(O2-)转化成H2O2,保护机体免受氧化的损伤[15]．CAT是生物体内过氧化物酶类的标志酶,能够将体内的H2O2分解成水和氧气,保护机体免受氧化的危害．SOD和CAT的活力高低可以反映抗氧化体系活性氧清除机制的高低,也能侧面反映体内活性氧水平．本研究中,高低浓度硫化物组刺参幼参SOD和CAT活性都出现了明显的升高,这说明短时间内合适浓度硫化物会增加抗氧化酶活性,表现出明显的“毒物兴奋作用”[16]．SUN等[17]研究表明硫化物能增加SOD活性,尤其是Mn-SOD的活性．本研究结果与管越强的硫化物对日本沼虾胁迫的结果一致[5]．

谷胱甘肽是一种重要的抗氧化物质,它能够清除氧自由基．有研究发现,生物内的谷胱甘肽含量与环境胁迫有关[18]．在一定的胁迫条件下,谷胱甘肽含量显著增加[19]．本试验中,在硫化物暴露下,刺参肠道的谷胱甘肽含量显著增加,这与上述研究结果一致．

硫化物的毒性作用,使刺参体内的O2-含量增加,刺激了刺参体内的抗氧化防御机制,从而使体内的抗氧化防御酶活性上升．在刺参体内,O2-会经过超氧化物歧化酶SOD的歧化作用,转化为H2O2．生成的H2O2又经过氧化氢酶和谷胱甘肽的催化生成H2O和O2,从而减轻毒害作用．本试验中,硫化物暴露后,刺参肠道中各种酶活性的变化是抗氧化防御体系为保护机体而产生的毒性响应,是刺参对硫化物毒性的一种适应．

4 结 论

刺参与其他水生生物相比,对硫化物的耐受力较弱, 24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为 4.397、3.769、3.001、2.678 mg/L,SC为0.267 8 mg/L．硫化物会显著影响刺参的存活率、附壁率和抗氧化防御能力．在硫化物暴露下,低浓度硫化物处理组刺参幼参T-AOC始终略高于对照组．而高浓度硫化物处理组在24 h时显著高于对照组,随后随时间不断下降,至96 h,显著低于对照组．SOD和CAT活性均在硫化物暴露72 h内不断升高,至72 h,高、低浓度硫化物处理组均显著高于对照组,72 h后变化不大．硫化物处理下高、低浓度组GSSG+GSH含量始终高于对照组(P<0.05)．