四甲基戊二酸对蛹虫草生长发育的影响

贺立虎，房海珍，李娟丽，萨达提·吾买尔

(1.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西西凤酒股份有限公司，陕西 凤翔 721406;3 新疆阜康市职业中等专业学校，新疆 阜康 831500)

蛹虫草(CordycepsmilitarisLink)隶属于虫草科(Cordyycepscipitaceae)虫草属(Cordyceps)，虫草素、虫草酸、多糖、SOD酶等是虫草类真菌中主要活性物质[1～3]，具有提高免疫力、抑制肿瘤等多种功效[4～6]。但野生冬虫夏草产量较低，价格高达每千克二十余万元，资源也日趋减少，致使其价格不断上涨。而蛹虫草为人工培养，栽培技术日益成熟，已实现产业化生产，价格仅为100元·kg-1。但是由于菌种退化和人工培养环境影响因素较多，产量和品质仍是目前蛹虫草生产需要解决的问题。四甲基戊二酸可通过调节生物体内蛋白质代谢，加快生物体生长，达到增产，改善品质的作用。笔者探讨了四甲基戊二酸对菌丝和子座生长的影响规律，建立相应的数学模型，探究其对蛹虫草生长的影响机理，确定最适添加量，为工厂化生产中提高蛹虫草产量和品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 供试菌种由西北农林科技大学提供，菌株编号为CM-16。

1.1.2 培养基 主要有:

母种培养基：马铃薯200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨3 g，琼脂粉12 g，水1 000 mL(pH6.5～7.0)。

原种培养基：葡萄糖10 g，蔗糖10g，蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，柠檬酸铁胺0.5 g，水1 000 mL(pH7.0)。

栽培原料：小麦。

栽培容器为：300 mm×200 mm×110 mm专用塑料盒。

1.1.3 植物生长调节剂 四甲基戊二酸(TGA)

1.2 方法

1.2.1 菌种制备 将蛹虫草母种活化2次，转接到母种平板培养基，菌丝体长满后即为一级菌种。

将一级菌种定量转接原种培养基，置于24℃、190 r/min震荡培养箱培养5d，再定量转接至原种液体培养基，按上述条件培养3d即为栽培用的液体菌种。

1.2.2 四甲基戊二酸对菌丝生长的作用 将TGA添加在母种培养基中制备得到试验用平板培养基，使其浓度分别为0，0.01，0.1，1，5，10和15 mg·L-1，各浓度水平重复5次。将直径为9 mm的“菌饼”接种在平板培养基上，培养条件温度约18℃、空气湿度约65%，每隔3 d测量标记并测量菌落直径[7]。

1.2.3 四甲基戊二酸对子座生长发育的影响 TGA试验水平：分别为0，1，2，3，4和5 mg·L-1，其添加量以蛹虫草栽培用水量(每盒450 mL)计算。

方法：按照常规熟料方法栽培，每盒添加风干小麦300 g，不同浓度四甲基戊二酸水溶液450 mL，于121℃灭菌60 min，冷却到25℃以下接种，每盒接种量40 mL。将接种后的栽培盒于温度18～21℃、空气相对湿度80%～90%、CO2体积分数小于0.2%～0.3%的条件下黑暗培养6 d，从第7天开始每天光照8 h，光照强度400 lx，所有栽培盒均随机摆放，定期调换摆放位置。

测定指标：当盒内90%左右的子座顶部膨大时采收，测定子座长度、直径、密度、鲜质量，计算生产周期、基质利用率等指标。

基质利用率=[(初始基质风干质量-剩余基质风干质量)/初始基质风干质量]×100%。

1.2.4 数据处理 采用SPSS和EXCEL图表进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 四甲基戊二酸对菌丝生长速率的影响

由图1可见，当TGA浓度为0～0.1 mg·L-1时，对菌丝生长速率的影响不大；当TGA浓度为0.1～15 mg·L-1时，菌丝生长呈现先升后降趋势，当浓度为5 mg·L-1时菌丝生长最快，达到3.88 mm·d-1。表明不同浓度TGA对菌丝生长呈现出低促高抑的作用。

2.2 四甲基戊二酸对子座生长发育的影响

2.2.1 四甲基戊二酸浓度对子座分化时间的影响 由图2可见，TGA能促进子座提前分化，不同浓度对子座分化时间影响不同；TGA浓度为1.0 mg·L-1时，子座形成最早，比对照提前1.6 d。随着浓度增高，分化时间逐渐延长，浓度为5 mg·L-1时子座形成最晚。

经计算可得蛹虫草子座分化时间(Y2)与TGA浓度(X2)之间的函数关系：

Y2=16.9816-1.5940/X2

(1)

对方程(1)进行方差分析可得：F回归=29.09>F0.01(1,4)=21.2，P=0.0057<0.01，表明该方程达到极显著水平，此模型成立。

对方程(1)求极值得：

X(2)max=1.0(mg·L-1

Y(2)max=15.4(d)

即TGA浓度为1.0 mg·L-1时，蛹虫草子座分化的最早为15.4 d。

2.2.2 四甲基戊二酸浓度对子座长度的影响 由图3可见，随着TGA添加浓度的提高，子座的长度迅速增加，过量的添加不利于子座的伸长

经计算可得子座长度(Y3)与TGA浓度(X3)之间的函数关系：

Y3=-0.502X34+6.298X33+27.162X32+43.935X3+59.53

(3)

对方程(2)进行方差分析可得：P=0.0395<0.05，表明该方程达到显著水平。

对方程(2)求极值得：

X(3)max=1.35(mg·L-1)

Y(3)max=83.2(mm)

即TGA浓度为1.35 mg·L-1时，子座长度为83.2mm，达到最长。

2.2.3 四甲基戊二酸浓度对子座直径的影响 经计算得子座直径(Y4)与TGA浓度(X4)的函数关系：

Y4=3.4757+0.878349/X4

(3)

对(3)式方差分析得：F回归=20.077>F0.05(1,4)= 7.71，P=0.011<0.05，表明该方程达到显著水平。

对方程(3)求极值得：

X(4)max=1.0(mg·L-1)

Y(4)max=4.35(mm)

即TGA浓度为1.0 mg·L-1时，子座直径最大为4.35 mm。

由图4可见， TGA浓度增加至1.0 mg·L-1时，子座直径急剧增大，达到最高为4.35 mm；当浓度大于1.0 mg·L-1，随浓度升高子座直径迅速减小，浓度在5 mg·L-1时子座最细；低浓度TGA能够刺激子座横向生长，而高浓度会抑制生长，使子座直径纤细。

2.2.4 四甲基戊二酸浓度对子座密度的影响 由图5可见,随着TGA浓度的增加，子座密度虽先减小后增大，但整体变化不大。表明TGA对单位面积子座数量的影响不显著。对4/5值进行校正。原因是子座直径增加后，密度必然减少。

2.2.5 四甲基戊二酸浓度对子座鲜质量的影响 图6经计算可得子座鲜质量(Y6)与TGA浓度(X6)之间的函数关系为：

y = 0.927x3- 10.31x2+ 24.28x + 231

(4)

对方程(4)进行方差分析可得：F回归=17.319>F0.05(2,3)=9.55，P=0.0551<0.05，表明该方程达到显著水平，此模型成立。

对方程(4)求极值得：

X(4)max=1.47 (mg·L-1)

Y(4)max=247.35(g·盒-1)

即TGA浓度为1.47 mg·L-1时，蛹虫草产量最高为每盒247.35 g。

从图6可见，当四甲基戊二酸浓度增加至1.47 mg·L-1时，子座鲜质量迅速增加，达到最高为247.35 g·盒-1。当浓度高于1.47 mg·L-1时，子座鲜质量随浓度的增加迅速降低，5 mg·L-1时降至最低，且低于对照组。

2.2.6 四甲基戊二酸浓度对生产周期的影响 由图7经计算可得生产周期(Y7)与TGA浓度(X7)之间的函数关系为：

Y7=-0.1306X73+1.1685X72-2.4593X7+47.612

(5)

对方程(5)进行方差分析可得：F回归=29.03>F0.05(2,3)=9.55，P=0.0335<0.05，表明该方程达到显著水平，此模型成立。

对方程(5)求极值得：X(7)max=1.45(mg·L-1)，Y(7)max=46.1(d)

即TGA浓度为1.45 mg·L-1时，蛹虫生产周期最短为46.1d。

由图7可见，TGA浓度为1.45 mg·L-1时，生产周期最短为46.1 d，比对照缩短1.5 d。随着添加浓度的继续升高，生产周期逐渐延长。表明低浓度的TGA有利于子座发育成熟，提前采收期。

2.2.7 四甲基戊二酸浓度对基质利用率的影响 由图8经计算可得基质利用率(Y8)与TGA浓度(X8)之间的函数关系为：

Y8=X8/(-0.292436+0.434463X8)+35.3025

(6)

对方程(6)进行方差分析可得：F回归=40.5889>F0.01(2,3)= 30.81，P=0.0067<0.01，表明该方程达到极显著水平，此模型成立。

对方程(6)求极值得：X(8)max=1.0(mg·L-1)Y(8)max=42(%)

即TGA浓度为1.0 mg·L-1时，蛹虫草对基质的利用最充分为42%。

由图8可见，试验范围内基质利用率均高于对照组。表明TGA能够加快蛹虫草对基质营养的吸收利用；当TGA浓度增加至1 mg·L-1时，基质利用率迅速上升至最高为42%。这一浓度下子座鲜质量也达到最高，表明此浓度下可以加快子座对基质营养的吸收利用，提高子座产量。随着浓度的继续增加，蛹虫草对基质营养的吸收利用逐渐减弱。

3 结论与讨论

3.1 四甲基戊二酸能够促进蛹虫草菌丝生长

培养基中添加适量的四甲基戊二酸能够起到增强细胞活力，刺激菌丝生长部位的敏感性，加快生长速率的作用，以5 mg·L-1浓度下促生长作用显著高于其它浓度。浓度过低时对其它内源激素的刺激作用弱，达不到显著促生长作用，浓度过高时则会打破激素间的平衡，无法正常生长。

3.2 四甲基戊二酸能够促进蛹虫草子座生长发育

不同浓度的四甲基戊二酸对蛹虫草营养生长和生殖生长阶段均有促进作用。添加浓度在1～2 mg·L-1范围时，四甲基戊二酸能够作用于细胞，充当内源激素的作用，提高菌丝生长部位的敏感性，使菌丝生长加快，原基分化提早完成，子座采收提前。低浓度作用下细胞活力旺盛，生长代谢加快，对基质营养吸收转化更加充分，产量明显提高。而高浓度对生长发育的促进作用明显减弱，甚至产生了抑制作用。

四甲基戊二酸能够通过参与生物体内的多种主要代谢过程，来实现改良品质和增产的目的。固体栽培过程中子座长度、直径、产量和基质利用均呈现正相关，表明四甲基戊二酸低浓度作用下能够使蛹虫草细胞快速分裂、变大，子座粗壮。同时低浓度下能够快速渗入细胞，提高细胞内原生质的流动，增强细胞活力，抗逆性增加，基质中碳源和氮源等营养吸收更充分，提高了基质的利用率，使生物量增加，产量提高。戊二酸浓度超出适宜的范围后，破坏了蛹虫草内源激素间的平衡作用，且过高的浓度使细胞渗透压加大，不利于原生质的流动，细胞生长受到抑制，各项指标均有所下降。

综上所述，生产中可添加四甲基戊二酸浓度在1～2 mg·L-1范围内以提高蛹虫草产量。以添加浓度为1.0 mg·L-1时蛹虫草生长发育状况为最佳。子座分化时间为15.4 d；子座长度83.2 mm；直径达到4.35 mm；生产周期最短为46 d；基质利用率为42%。