荧光PCR技术应用于芥辣调味品原料真伪鉴别

何永盛，连晓聪，花振新，罗北照，冯美红

精益和泰质量检测股份有限公司（广州 510700）

芥辣调味品以其独特的风味与口感，成为了生鲜山葵和辣根都是制作芥辣调味产品的常用原料，然而两者在经济价值上却存在着较大的差异。山葵又名山萮菜，原产于日本，是一种营养丰富的食用保健植物，具有免疫调节、抗菌、抗氧化等多种药理作用，在国际市场上的需求很大，价格也较为昂贵[3]。辣根虽然与山葵同属十字花科植物，但价格却只有山葵的五分之一左右，而且具有易栽种、生长周期短等优势，因此被很多商家作为山葵的“代替品”来使用[4]。

在实际生产过程中，商家为了节约成本，往往会在辣根泥中加入色素进行调色，以此作为原料制作Wasabi等芥辣调味品[5]。加工后的辣根调味料与山葵调味料在形态上较为相似，难以通过外观及味道上的细微差别来鉴定其原料属性。由于山葵与辣根原料在价格上存在较大的差异，不法商家为了获取高额的利润，有可能以低价的辣根来冒充山葵原料制作芥辣调味品，这种掺伪造假的行为侵犯了消费者的知情权，也对其经济利益造成了一定的损失。

目前，山葵和辣根原料的鉴定仍缺乏有效的技术手段，虽然有学者尝试分析两者的化学成分，但由于山葵和辣根的主要风味成分都是异硫氰酸酯类物质，所以也难以通过此类方法进行准确的鉴别[6-8]。与此相比，由于荧光PCR技术具有快速、准确且不受样品形态限制等优点，近年来在动植物原料成分鉴定研究方面得到了越来越广泛的应用[9-11]，因此研究拟借助此技术建立可以用于鉴别山葵和辣根成分的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山葵、辣根以及用于方法验证的多种动植物材料和芥辣调味品均购自当地超市或网络平台。

荧光定量PCR仪（型号：7500），美国ABI公司；超微量核酸蛋白测定仪（型号：Q5000），美国Quawell公司；高速冷冻离心机，德国Wiggens公司。

DNA提取试剂盒（DNeasy mericon Food Kit），德国QIAGEN公司产品；PCR预混液2×premix ExTaq，宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成

选取山葵和辣根各自的特异性基因，通过与NCBI数据库中的其他物种序列进行比对，分别设计相应的检测引物和探针，序列如表1所示。试验中所用引物和探针均委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，各引物和探针在使用前统一用灭菌去离子水稀释至10 μmol/L。

表1 山葵和辣根检测引物及探针

1.2.2 样品DNA的提取

采用QIAGEN公司的DNeasy mericon Food Kit，对购买的山葵和辣根样品以及其他用于方法特异性验证的样品进行DNA提取，操作方法见其使用说明书。各样品基因组DNA在上机测试前统一稀释至25 ng/μL。

1.2.3 PCR反应体系及程序

山葵检测反应体系：总体积为20 μL，其中2×premix ExTaq为10 μL，引物SK-Forward和SK-Reverse各0.4 μL，探针SK-Probe为0.2 μL，样品DNA为2 μL，灭菌去离子水为7 μL。

辣根检测反应体系：总体积为20 μL，其中2×premix ExTaq为10 μL，引物LG-Forward和LG-Reverse各0.4 μL，探针LG-Probe为0.2 μL，样品DNA为2 μL，灭菌去离子水为7 μL。

山葵和辣根检测反应的程序均为：95 ℃时1 min；95 ℃时15 s，60 ℃时1 min，40个循环。

1.2.4 结果判定

在山葵检测反应中，若待测样品的Ct值＜35，则可判定样品中含有山葵成分；若Ct值≥35，则可判定样品中未检出山葵成分。

在辣根检测反应中，若待测样品的Ct值＜35，则可判定样品中含有辣根成分；若Ct值≥35，则可判定样品中未检出辣根成分。

1.2.5 方法特异性验证

选取大米、大豆、猪肉、罗氏虾等不同的动植物样品作为检测对象，分别使用山葵和辣根特异性引物及探针进行荧光PCR扩增，以验证所建立方法的检测特异性。

1.2.6 方法灵敏度测试

设置两个试验组：在试验组1中将浓度同为25 ng/μL的山葵DNA和辣根DNA按1∶1 000的比例进行均匀混合，以此作为待测样品，加入到山葵检测反应体系中进行荧光PCR扩增；在试验组2中将浓度同为25 ng/μL的山葵DNA和辣根DNA按1 000∶1的比例进行均匀混合，以此作为待测样品，加入到辣根检测反应体系中进行荧光PCR扩增。

1.2.7 样品检测

在网络平台和商场购买不同品牌的芥辣调味产品，提取各样品的基因组DNA，用建立的检测方法鉴别其是否含有山葵和辣根成分，以验证该方法在实际样品检测中的适用性。

2 结果与分析

2.1 山葵和辣根检测反应体系扩增结果

在山葵检测反应体系中加入50 ng的山葵DNA，同时在辣根检测反应体系中加入50 ng的辣根DNA，按照前述的反应程序进行荧光PCR扩增，检测结果如图1所示。结果显示，山葵和辣根样品的DNA在各自的检测反应体系中都出现了典型的扩增曲线，且Ct值＜35，说明研究建立的检测方法可以有效地鉴别山葵和辣根成分。

图1 山葵和辣根样品的荧光PCR扩增结果

2.2 方法的特异性试验结果

以购买的山葵、辣根以及其他19种动植物样品对方法的特异性进行检验，从表2的试验结果可以看出，研究建立的山葵成分检测方法仅对山葵样品有特异性扩增，同时辣根成分检测方法仅对辣根样品有特异性扩增，而其他19种样品在两种反应体系中均未检出山葵或辣根成分，说明研究建立的方法具有良好的特异性。

表2 方法特异性试验结果

2.3 方法灵敏度测试结果

以25 ng/μL的山葵DNA和25 ng/μL的辣根DNA为母液，分别按照1∶1 000和1 000∶1的比例制作混合样品DNA，以此作为方法灵敏度的测试样品，分别用于山葵和辣根反应体系的扩增。图2的试验结果显示，体积浓度为0.1%的山葵DNA和辣根DNA可以分别在山葵反应体系和辣根反应体系中扩增出典型的曲线，且Ct值＜35，说明研究建立的山葵和辣根检测方法的灵敏度均可达到0.1%。

图2 山葵和辣根检测方法的灵敏度试验结果

2.4 样品检测结果

在当地市场和网络平台上购买7批次芥辣调味品，用建立的山葵和辣根成分检测方法对各批次样品进行检测，并将所得结果与产品标示的原料成分进行对比。表3的结果显示，研究建立的实时荧光PCR方法能够适用于市售芥辣调味品的实际检测，其中有6批次样品的检测结果与产品标标的原料成分一致，但有1批次样品出现了与产品标示原料成分不一致的情况，说明商家可能对此产品进行了掺伪造假。

表3 市售芥辣调味品的检测结果

3 结论与讨论

研究建立的实时荧光PCR检测方法能够准确鉴别芥辣调味品中的山葵和辣根原料成分。在对市售芥辣调味品的检测中，发现确实有商家利用低价的辣根原料冒充山葵原料的情况出现，因此该方法的建立可以为有关部门对芥辣调味产品原料真伪情况的监督提供有力的技术支持。此外，研究建立的方法仍有进一步改良的空间，比如可以通过优化PCR体系，建立在一个反应中同时鉴别山葵和辣根成分的双重实时荧光PCR检测方法等，有待在后续的研究中加以完善。