响应面法优化低共熔溶剂提取桑叶DNJ

王璐，许路路，陈雄，赵宇明，韩静

沈阳药科大学（本溪 117004）

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ），可以抑制α-葡萄糖苷酶活性、降低血糖、抑制病毒活性、抑制肿瘤转移、还可以与胰岛素连用增加其敏感度[1]。DNJ的来源分为植物和微生物，桑的枝、叶、根中DNJ含量在已知动植物中最高[2]。虽然DNJ化学合成的方法很多，但是存在操作复杂，产率低，污染大等问题，中国桑叶资源丰富，丝绸产业下滑，桑叶资源利用不充分，所以桑叶中DNJ提取分离纯化十分紧迫。

低共熔溶剂[3]（DES）定义为特定摩尔比的氢键受体和氢键供体形成的均一、澄清、透明的液体，为2种或多种组分的混合物。DES作为一类新出现的溶剂，它的优点有原料普遍、价钱合理、操作简便、不必纯化等。它被广泛应用在化学合成、气体吸收、药物缓释、催化、提取、电化学等领域[4-6]，在天然产物提取中的应用有人参皂苷、花色素、石蒜科生物碱[7-9]。因此，可针对提取物体的性质选出最适合的DES溶剂，循环利用，以节约成本，减少污染[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑叶（辽宁本溪农户提供，中药学院袁丹教授鉴定为药桑（Morus nigra L.））；1-脱氧野尻霉素标准品（纯度98.9%，上海新铂化学技术有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl，阜阳曼林生物技术有限公司）；氯化胆碱、甘油（分析纯，天津市富宁精细化工有限公司）。

1.2 仪器与设备

Scientz IID超声细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；L-2130高效液相色谱仪（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

称取桑叶粉末1.0 g，按料液比1∶20（g/mL）加入低共熔溶剂（含水量50%），在40 ℃，150 W，使用超声细胞破碎机提取1 次，时间10 min，提取液以10 000 r/min离心15 min，抽滤，少量水润洗滤渣，获得桑叶DNJ提取液。

1.3.2 DNJ检测方法

1.3.2.1 样品的衍生化处理

精密称取DNJ标准品2.0 mg，用0.05 mol/L盐酸定容于10 mL容量瓶，取70 μL的DNJ的标准品溶液或样品溶液与338 μL浓度为0.4 mol/L硼酸钾缓冲液（pH 8.5）混合，加入500 μL浓度5 mol/L氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl溶于50%乙腈溶液），25 ℃水浴20 min，加入50 μL浓度1 mol/L甘氨酸，25 ℃水浴5 min终止反应，加入1%乙酸132 μL及超纯水324 μL[10]，涡旋混匀，过0.45 μm滤膜收集待测。

1.3.2.2 色谱条件

高效液相色谱（HPLC）检测，色谱柱Supersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：乙腈-0.1%乙酸水溶液（40∶60，V/V）。检测器紫外波长254 nm；进样量10 μL；流速1.0 mL/min；柱温25℃，桑叶DNJ提取液进样。

1.3.2.3 标准曲线建立

将DNJ标准品配制成梯度浓度溶液（14.28，20，40，60，80和100 μg/mL），衍生化处理后进行HPLC测定。以标准品质量浓度x对峰面积y进行线性回归绘制标准曲线，得到回归方程y=1 371.2x+3 478.4，R2=0.999 2，在14.28～100 μg/mL范围内质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

1.3.2.4 桑叶DNJ提取量的计算

桑叶DNJ提取量计算如式（1）。

式中：X为根据标准曲线计算的提取液的质量浓度，μg/mL；V0为桑叶DNJ提取液体积，mL；M为桑叶样品质量，g。

1.3.3 DES种类的筛选

1.3.3.1 DES的种类（参见表1）

表1 DES种类

1.3.3.2 DES的制备

按照摩尔比将氢键供体和氢键受体混合，在65 ℃水浴锅中加热约30 min，充分搅拌混匀，得到澄清、透明、微黏稠的液体状溶剂，在10 000 r/min的转速下离心10 min，无固体析出，按照比例加入去离子水，制成DES备用。

1.3.4 单因素试验

按照1.3.1的方法，分别对氯化胆碱甘油摩尔比（2∶1，1∶1，1∶2，1∶3和1∶4）、超声时间取（10，20，30，40，50和60 min）、DES含水量（10%，20%，30%，40%和50%）3个因素进行考察，得到其对DNJ提取效果的影响，每组重复3次。

1.3.5 Box-Behnken试验设计

对单因素进行分析，将氯化胆碱甘油摩尔比、低共熔溶剂含水量、超声时间这3个因素作为Box-Behnken的自变量，响应值为桑叶DNJ提取量，用响应面法进行分析优化，三因素三水平响应面具体数据见表2。

2 结果与分析

2.1 DES种类的筛选

由图1可知，总体上，氯化胆碱制备成的低共熔溶剂对DNJ的提取优于甜菜碱，DESs-1氯化胆碱与甘油制备DES提取桑叶中的DNJ效果最好。

图1 DES的种类对提取的影响

2.2 单因素试验

2.2.1 氯化胆碱与甘油摩尔比对提取效果的影响

一般而言，大多数DES黏度随温度升高和氢键供体增多，黏度减小[11]。由图2可看出，氯化胆碱与甘油摩尔比1∶3时提取量最多，氯化胆碱量低时，可能形成较少的分子内氢键，并且黏度很大，不利于与桑叶粉末充接触，随着甘油的增多，黏度下降，提取量增加，但是摩尔比1∶4时，提取量下降，可能是形成的低共熔溶剂不稳定，氢键减少所造成。因此，摩尔比1∶3更有利于DNJ的提取。

2.2.2 超声时间对提取效果的影响

由图3可得出，DNJ的提取量随时间的延长而增大，30 min时，提取值最大，含量逐渐降低。这可能是因为长时间提取，桑叶粉充分吸收提取溶剂，黏稠度增加，过滤困难，过滤出的桑叶体积减少。

2.2.3 DES含水量对提取效果的影响

室温下的DES的高黏度限制其应用，加水降低黏度，增加传质速度，提高提取产率[12]，由图4可看出，随着溶剂中含水量逐渐增大，DNJ提取量的波动在40%时达到最大，可能是由于分子间的氢键比较多，黏度比较适合DNJ溶出，含水量50%时，提取效率降低，可能是过量的水会导致现有氢键的损失，破坏DES的特殊结构[13]。含水量30%时，提取量比较低，这种现象可能是因为DNJ类化合物与DES相互作用形成聚合物，或者因为DES的稳定性下降[14]。

图2 氯化胆碱与甘油摩尔比对DNJ提取量的影响

图3 超声时间比对DNJ提取量的影响

图4 DES含水量对DNJ提取量的影响

2.3 响应面试验

根据单因素的分析结果，按照响应面的试验方法，选择氯化胆碱甘油摩尔比、含水量、超声时间进行三因素三水平的响应面分析方法。

优化桑叶DNJ的最佳提取条件，结果见表3，使用Design-Expert 10对试验结果进行拟合，得到DNJ提取量对氯化胆碱甘油摩尔比（A）、含水量（B）、超声时间（C）数学回归模型：Y=-2.3+0.6A+0.11B+0.04C+0.000 25AB+0.003 7AC+0.000 071BC-0.11A2-0.000 14B2-0.000 85C2。

表3 响应面设计及结果

由表4可知，二次回归分析模型p＜0.000 1显著性良好，失拟项大于0.5不显著，决定系数R2=0.999 5，校正决定系数R2adj=0.998 8，证明实测值与模型预测值之间具有良好的拟合性，模型可用于分析影响DNJ的提取量的因素。

表4 回归模型和方差分析

2.4 响应面分析

超声细胞破碎机辅助提取桑叶DNJ的响应面见图5。固定1个变量，随着另一个变量的增加，DNJ提取量先增加达到最大值后下降，含水量（B）和超声时间（C）、氯化胆碱甘油摩尔比（A）和超声时间（C）的平面图呈椭圆形，表明两者的交互作用明显。

图5 各因素及其交互作用对超声辅助提取影响的响应面

2.5 验证试验

由模型可以看出，桑叶DNJ的超声细胞破碎机辅助提取工艺最优条件为：氯化胆碱甘油摩尔比1∶3.34，含水量40.445%，超声时间31.74 min。该条件下提取含量为1.447 mg/g，为减少实际操作的繁琐复杂，将氯化胆碱甘油摩尔比、含水量和超声时间调整为1∶3.4、40%和32 min。进行3次平行试验，桑叶DNJ平均提取量为1.445±0.001 8 mg/g，与理论值1.447 mg/g接近。证明模型拟合结果良好，优化的工艺条件可靠，对实际生产有帮助。

3 结论

桑叶DNJ的最佳条件为：氯化胆碱甘油摩尔比1∶3.4，含水量40%，超声时间32 min，重复3次。此时DNJ平均提取量为1.445±0.001 8 mg/g，与理论值1.447 mg/g接近。DES提取提高了桑叶中DNJ提取量，并且DES制备简单、可循环利用、生物降解性良好，还可增加提取物稳定性，延长保存时间，为桑叶提取开发利用和天然产物的提取纯化保存提供思路。