丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法研究

2020-08-25刁保忠靳维荣周德刚

临床医药文献杂志(电子版) 2020年47期

刁保忠，靳维荣，周德刚

（聊城市人民医院制剂科，山东聊城 252000）

丹参是唇形科鼠尾草属植物，性苦，微寒，归心、肝经，功效以祛瘀止痛、活血通经等为主，是当下治疗心血管疾病的传统中药之一。现代药理学研究指出，丹参的有效成分以酚酸类及黄酮类为主，酚酸类是一类含有酚羟基的有机酸类化合物，属于丹参茎叶与丹参药用部位类似的成分[1]。本次研究基于前人研究结果的基础上，将丹参茎叶内酚酸类及黄酮类成分设为研究对象，对其提取纯化工艺作出如下研究。

1 仪器与试剂

Agilent 1200型液相色谱仪，Agilent TC C18色谱柱与保护柱；玻璃层析柱。药用乙醇，

高纯水（自制），丹参素钠等。丹参取自天士力商洛GAP种植基地。样品在48℃条件下热风烘干，干燥后经粉碎处理后过40目筛，于常温下密封干燥、保存以备用。

2 方法

2.1 检测丹参茎叶酚酮类成分

（1）确定色谱条件：色谱柱是Agilent TC C18；柱温、流动相、流动相、体积流量、进样量依次为35℃，乙腈-0.1%甲酸水溶液、0.4 ml/min、2 μL。用于检测波长280 nm（丹酚酸类）与254 nm（黄酮类）。

（2）制取对照品溶液：精确称取丹参素、原儿茶酸、芦丁、异槲皮苷，放置于棕色量瓶内，加入90%甲醇以制备含丹参素0.155 mg/mL、原儿茶酸0.115 mg/mL、芦丁 0.123 mg/mL、异槲皮苷 0.122 mg/mL的混合对照品溶液。

（3）制取供试品溶液：具体是取适量溶液，定容处理到相应容积，充分混合，滤过，12500 r/min离心处理12 min，提取上层清液，采用0.22 μm微孔滤膜滤过处理后即可获得。

（4）考察线性关系：提取混合对照组溶液，分别稀释到2、10、100倍，用0.22 μm微孔滤膜滤过处理，依照“（1）”中的色谱条件依次分析，将对照样品的质量浓度、峰面积分别设为横坐标（X）、纵坐标（Y），勾画标准曲线，进行线性回归分析，计算出相应的回归方程。

（5）精密性试验：量取混合对照品溶液持续进样5次，记录各对照品对应的色谱峰峰面积。若各对照品色谱峰峰面积的RSD均＜1.34%，则提示仪器精密性优良。

2.2 研究丹参茎叶的提取纯化工艺

（1）考察提取方法：①超声提取：取丹参茎叶药材适量，粉碎处理后过40目筛，精确量取5 g粉末，采用料液比为1∶8、乙醇超声（300 W，50 kHz）连续提取2次，每次对应的提取时间均为30 min，检测指标成分的含量。②乙醇回流：取材适量，粉碎后依然过40目筛，称取5 g粉末，料液比为18，乙醇回流进行2次提取，每次对应的提取时间为60min，定量检测。结果表明，在指标成分提取率比较上，进行单因素与正交试验考察。

（2）提取时间：取材适量，粉碎处理后过40目筛，称取粉末5 g，利用60%乙醇，料液比1:8，提取1次，考察不同的提取时间点（1.0、1.5、2.0、2.5 h）对提起成分总量形成的影响。结果提示，伴随时间的推延，丹参茎叶酚酸类及黄酮类成分含量有上升趋势，且在2.0 h时达到峰值，随后有降低趋势。提取时间为1.0、1.5、2.0、2.5 h时，黄酮类成分含量分别为3.95、4.06、3.98、3.82，酚酸类依次为36.47、36.83、39.60、37.76，总量分别为40.44、40.88、43.58、41.61（单位㎎/g）。因为丹酚酸B稳定性偏差，不适合长时间加热，故而选择1.0、2.0 h进行正交试验。

（3）提取频次：伴随提取频次的增加，成分总量有不断上升的趋势，提取3次后总量不再上升。

（4）正交试验：取材适量，粉碎后过40目筛，精确量取6份药材，每份均5 g，依照L9（34）正交试验表进行试验。依照单因素试验结果，选择乙醇体积分数（A）、提取时间（C）及提取频次（D）3个因素，考察最优的提取工艺条件。试验结果表明，各因素作用主次为D＞C＞A。见表1。

表1 L9（34）正交试验设计与直观分析

2.3 纯化工艺

利用静态吸附法，筛选出丹参茎叶纯化对应的最适树脂。精确量取 D101、HDP-100、X-5、AB-8湿树脂各1.0 g，分别放置在50 mL三角烧瓶内，依次加入最佳工艺参茎叶浓缩提取液（10 mL），混合摇匀。对静态饱和吸附的树脂进行过滤处理，加入10ml 50%乙醇，再次混合摇匀，检测吸液内黄酮类与酚酸类成分量，测算各树脂对应的解吸率。结果表明，X-5、AB-8两者的吸附效果无显著差异。

用AB-8 型大孔吸附树脂予以纯化，40%乙醇洗脱，洗脱用量为3BV是最佳纯化工艺，酚酸类及黄酮类成分总纯度能达到42.17%