水产用蛭弧菌11问

水产用蛭弧菌近几年又火了起来，因为化学消毒剂在控菌方面虽然效果来得快，但在控菌时间上面存在着严重的缺陷，用后12～24h左右，总菌数就有可能反弹超标，而水产用蛭弧菌在这方面恰恰存在着一定的优势，但是作为一个生物制剂，其不确定性也存在很多方面，为此作者将用11个小问题来围绕蛭弧菌做一些讲解，希望能让大家更好的了解蛭弧菌产品。

1 蛭弧菌是什么？

在水产养殖技术上，只要你不彻底排斥消毒，那么蛭弧菌就是绕不开的一个产品。

首先要了解什么呢？最简单的，我们要知道蛭弧菌到底是什么？——蛭弧菌是一种生物消毒剂！

人类目前拥有三种消毒方法：物理消毒法、化学消毒法、生物消毒法。

其中生物消毒法会用到生物消毒剂，它包括：植物提取物、细菌、噬菌体、生物酶、抗菌肽，这其中的的细菌一般就是指蛭弧菌。

蛭弧菌实际是在1962年由Stolp和Petzold首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌体中，随后从土壤、污水中都分离到了这种细菌。所以蛭弧菌从发现到现在才不过50多年的时间。

蛭弧菌命名为Bdellovibriobacteriovorus。其中，Bdello一词来自希腊字，是“水蛭”的意思，“vibrio”意为“弧菌”，而种名“bacteriovorus”是“食细菌”的意思。其命名很有意思，“水蛭”代表了其生理上的一些动作形为，蛭弧菌的捕食生活方式很特殊，它是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌。请注意，蛭弧菌不是从外到内吃掉其他细菌，而是钻到其他细菌体内，从内到外裂解其它细菌。

另外有，有些人一直分不太清楚噬菌蛭弧菌和噬菌体，实际很简单，前者是吃细菌的细菌，后者是吃细菌的病毒。

2 蛭弧菌到底长什么样子

首先蛭弧菌很小，0.3～0.6×0.8～1.2um，1mm的长度可以并排放2,500个左右，长度大概为杆菌的三分之一至五分之一，显微镜中至少要用到油镜才能看得到它，而且要在染色的情况下。因此被称为“世界上最小的捕食者”之一。

想像一下小蝌蚪，蛭弧菌差不多就是这个外形。它的脑袋呈弧形或者杆状，有时候也呈螺旋形，外加一个长尾巴鞭毛，与鞭毛相对的一端有钉状纤毛，被称为“感染锥子”。它的鞭毛很牛，明明个子比细菌要小不少，但鞭毛却比一般细菌的粗3～4倍。

3 蛭弧菌有什么独门绝技？

蛭弧菌有两个独门绝技可以打破敌人的防御，一是铁头功，二是无敌风火轮。

蛭弧菌入侵细菌的方式非常独特，首先，它到处游动，实际上一般10min左右它就会找到可以寄生的细菌，也就是宿主菌。然后它就用铁头功，猛烈碰撞宿主细胞，速度每秒高达100个细胞长度，如果是人的话，速度就是每秒一百七八十米，疯狂的撞击，无鞭毛的那一端附着于宿主细胞壁上，不过100次的碰撞大概只会有3次成功，相当不容易。

吸附成功后，蛭弧菌采用无敌风火轮，开始疯狂旋转，每秒几乎能达到100转，从钻孔到进入只需几秒种。不过进入宿主细胞之后，鞭毛就会不要了。

4 蛭弧菌的繁殖速度快么？

为什么使用蛭弧菌48小时后才能做平板检测？为什么蛭弧菌的见效时间这么长？

这主要是和蛭弧菌的繁殖速度有关系。实际上蛭弧菌生长速度是很慢的：

4.1 繁殖代时长

蛭弧菌繁殖一代的时间需要大概4h左右，在试验室状态下，大肠杆菌17min一代，枯草芽孢杆菌30min一代，这之间的差距是非常大的。

4.2 蛭弧菌不是指数级增长

蛭弧菌是自我复制式的生殖，一次可以产生6～36个后代。8h的极限数值才不过36×36=1,296个，如果是枯草芽孢在极限状态下，8h可产生65,536个后代，相差近51倍。

这就是蛭弧菌一个很大的问题，所以在实际使用的时候，建议加大剂量，或者连续多天使用。

5 蛭弧菌杀菌有选择性么？

蛭弧菌能区分善恶么？——可能么？即便是不做研究，我个人都认为不可能，自然界中会存在这样一种微生物？它知道我们水产养殖的有益菌有哪些而不进攻它们？

蛭弧菌与宿主细胞之间，常表现出一定的特异性。不过，有的特异性较差，能侵入多种细菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各类不同的植物病原菌。

从这一点上看，其比噬菌体（病毒）、细菌素（蛋白质）的广谱性要好。实际上蛭弧菌可感染许多不同科属的菌，但其总体上有一定偏向性，比如其可感染大多数革兰氏阴性细菌（如志贺氏菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、钩端螺旋体等微生物），但只对少数的革兰氏阳性细菌感兴趣，同时也有报道指出其对某些真菌和肠道病毒也有一定的裂解活性。

图1 （出自：孙秋平.蛭弧菌的分离纯化及保质期的研究[D].华南理工大学,2014.）

图2 48,000倍下的蛭弧菌[出自：宋志萍、蔡俊鹏、王志、韩韫，蛭弧菌的分离及其生长条件和裂解能力的研究，微生物学报，2005，45（4）：573.]

图3 氦离子显微镜下的蛭弧菌（像素大小0.75纳米）[出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

——寄生的特异性也对我们的实际使用方法有很大的影响，即蛭弧菌是不是不管好菌坏菌都会攻击？如果是这样的话，那么很难被我们所用了，但实际上，其有一定倾向性，这就给我们实际的应用提供了更多的可能性。

郭衍彪（2016年）的研究指出，蛭弧菌BDW03对试验组大菱鲆肠道没有控制作用的菌属为8个（占53.3%），这8个菌属中多为革兰氏阳性菌属（6/8）。另外，其通过乳酸菌拌食饵料和泼洒BALOs喂食大菱鲆60d后，乳酸菌和BALOs对大菱鲆肠道菌群中革兰氏阴性菌的控制作用（分别占总菌属的33.3%和26.7%）优于对革兰氏阳性菌的控制作用（分别占总菌属的（26.7%和20.0%）。这也间接指出了蛭弧菌对细菌的裂解可能有一定的偏向性。

另外，结合陈家长等人（2003）、徐琴等人（2006）、陈丽芸（2012）的研究，我们至少可以获得以下结论。

第一、不同类型的蛭弧菌能裂解的宿主菌是有差异的；

第二、蛭弧菌可以和光合细菌中的球形红假单胞菌混合使用，也可以间隔7d使用，外泼效果都非常好。蛭弧菌和粘红酵母混合使用，外沷效果不佳；同时外用蛭弧菌的效果控制时间至少可以达到2周，即14d的时间。而且这还是受限于方案的要求。

第三、蛭弧菌不裂解乳酸杆菌。

第四、在斑节对虾的试验研究中，蛭弧菌和枯草芽孢杆菌混合外沷使用没有单独使用蛭弧菌效果好。但混合使用比不使用的对照组在控制总菌上效果要好。

第五、对大菱鲆的内服研究表明，蛭弧菌对肠道内芽孢杆菌属的增殖影响比较小。

6 蛭弧菌和化学消毒剂的差别在哪里？

化学消毒剂包括抗生素的杀菌都有一个特征，来得快去得快，在达到一定浓度下，化学消毒剂的效力可能会在4个小时左右达到最高峰，细菌总数下降到最低，然后细菌总数会出现反弹，但消毒剂仍有效果，总菌数有可能在12～24h左右反弹超标，超过原来的细菌总数，当然，细菌的种类发生了变化。

而蛭弧菌可能在前1～2d内看不出来什么效果，但如果其能发挥效果，那么控菌的时长有可能达到15d以上，甚至20d以上，在此期间，总菌数、弧菌数相对于对照组可能会低1～2个数量级。

比如张吕平等人（2009）的研究指出，对虾池水体分别泼洒二氯异氰脲酸、季胺盐络合碘和蛭弧菌。当每隔20d左右分别进行一次上述水体处理,通过比较体内弧菌感染的对虾个体数,发现从肝胰腺分离到弧菌的对虾数量二者无显著差异,但从血淋巴分离到弧菌的对虾数量,蛭弧菌处理组显著少于化学消毒剂处理组。

能长期控菌，这是蛭弧菌的优势所在，也是与化学消毒剂最大的差异所在。

7 蛭弧菌耗氧么？可以扩培么？

蛭弧菌是严格的好氧菌，它的繁殖需要氧气，但它对池塘的溶氧几乎又没有什么干扰，为什么？因为它的繁殖速度太慢了。

有多慢，请参看上第四问。

另外，我们都知道，可以用红糖等碳源对乳酸菌及EM菌进行扩培，那蛭弧菌可以用这些营养物质扩培么？很明确，不可以。

因为蛭弧菌不利用碳水化合物，所以无法用碳源进行扩培。

实际上从自然界分离得到的蛭弧菌都是依赖寄生型，迄今为止，还没有直接从自然界分离得到非寄生型。不依赖宿主的蛭弧菌，只能生活在实验室条件下。

8 蛭弧菌有哪些产品可以选择？

市面上的蛭弧菌有三种：液体的、粉末状的、冻干粉。

图4 氦离子显微镜下的大肠杆菌（左）和葡萄球菌（右）细胞被蛭弧菌感染的图片。像素尺寸为1nm。[出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

图5 蛭弧菌的繁殖周期示意图[出自：Makowski L ,Trojanowski D ,Till R ,et al.Dynamics of chromosome replication and its relationship to predatory attack lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus[J].Applied and Environmental Microbiology,2019,85(14):-.]

液体使用方便，但菌数容易掉。而且蛭弧菌液体的产品始终面临保存的问题，实际上也有很多的论文对此做了研究，有的文章指出，大多数的液体蛭弧菌产品在4℃的环境下，可以保存8个月以上，少数6个月以上。但在25℃的环境下，蛭弧菌液体产品的保质一般只在4～6个月了。当然随着保护剂的不断研发，随着添加不同的保护剂，在4℃的环境下，某些液体产品的保质期可以达到15个月以上，有的可以达到两年以上，但是所有的保存环境温度都指向4℃，这对我们实际的销售场景是不太相符的。当然，液体也有好处，菌种复苏时间快，如果从实际销售出发，建议在经销点增设冷藏柜，这样可以延长液体产品的保持期。

粉末状有些说是托盘冻干的，有装到铝箔袋中的，也有装到西林瓶中的。

原装冻干粉则是近几年推出的产品，菌种的稳定性是无与伦比的，只能装到西林瓶中，而且每一瓶都必需是真空包装的。在相关的研究中，4℃的环境下，添加了保护剂的蛭弧菌液体产品在13个月后其复苏率为100%，而同样的环境下，冻干产品在21个月后其复苏率仍为100%。

而且真正的蛭弧菌原装冻干产品，具有以下优点：

冷冻干燥生产工艺是在低温下进行的，对于许多热敏性的物质特别适用。蛭弧菌不会发生变性或失去生物活力，这一点非常重要。

整个冷冻生产过程基本上是在低温真空状态下完成的，在这种状态下，微生物的生长和酶作用是受到抑制的，可以很好的保证蛭弧菌产品的稳定性。

因在真空下操作，氧气极少，因此，一些易氧化的物质（如油脂类）得到保护。

冷冻干燥法能排除95%～99%以上的水分，产品能长期保存而不变质。

以上就是蛭弧菌冻干产品的优势所在，也是其稳定性的保障所在。

9 蛭弧菌的冻干粉是如何生产的？

蛭弧菌冻干粉的生产需要两组机器，一是发酵罐，二是冻干机，前者几十万，后者近百万，硬件投资算是一个门槛。

9.1 发酵

蛭弧菌的发酵和其他产品就差别很大，蛭弧菌的发酵前后需要一周的时间，在微生物的发酵时间上，算是最长的一类了，生产起来较为麻烦。

9.2 冻干

冻干则更是一个精细的活了。

其基本流程包括：灌装、装盖、摆盘、冻干、压盖。当然可能使用一些自动设备，在具体的步骤上会略有差别。但总体步骤变化不大。

半成品进入冻干机后，通过冻结、升华、再干燥三个过程，通过升华过程将母液中的冰几乎全部散发掉后，再由机器统一压盖，保证每一瓶产品内均处于“真空”状态。

10 蛭弧菌原装冻干粉有什么特点？

蛭弧菌原装冻干粉的概念是我在2018年底提出，特指蛭弧菌母液和西林瓶一起在冻干机中完成冻干，每一瓶成品均为真空状态的产品。

这种产品有自己非常明显的一些特点：

第一、每一瓶都是真空，打开盖子能听到“嘭”的一声。

第二、橡胶塞子带导气槽，和普通的塞子有明显差别；

第三、里面的产品不是粉状的，是块状物，左右摇晃很明显；

第四、里面的块状物是速溶的，一秒即溶。

蛭弧菌原装冻干粉最大的特点就是产品的质量稳定性非常好。

图6 在不同时间点扫描蛭弧菌与大肠杆菌。蛭弧菌附着其猎物（10min≤t≤30min）、蛭质体的形成和演化（t＞20min）、蛭质体的溶解（t=3h）清晰可见 [出自：Said N ,Chatzinotas A ,Schmidt M .Have an Ion on It:The Life-Cycle of Bdellovibrio bacteriovorus Viewed by Helium-Ion Microscopy[J].2018.]

11 蛭弧菌如何使用？

首先，购买几瓶产品，使用前检测一次弧菌平板，使用48h后再检测一次平板，至少2～3个试验组，同时一定要有对照组，通过试验看效果，如果有效，则建议再行使用。之所以要划平板，因为蛭弧菌不是万能的，也不是在所有水体都可以存活的。

建议使用方法有这样几种：

一、在某些疾病发病高峰前的5～10d进行使用，加大2～3倍剂量使用效果更好。

二、在虾、蟹等甲壳类动物脱壳前5～10d使用，保护脆弱的脱壳期水产养殖动物。

三、在较长阴雨天前5～10d使用，防止阴雨天滋生大量有害细菌。

四、某些养殖动物刚发疾病，可以试着连用2d，每天1瓶冻干粉用2亩。

五、疾病已发，动物开始死亡，肯定首先要使用化学消毒剂，比如找到保真的过硫酸氢钾，先消毒，间隔24h后再使用蛭弧菌进行长期控制。

六、可以和光合细菌进行配合使用。

使用蛭弧菌的核心要求很清晰：一定要能长期的帮助我们水产养殖控制总菌数、异养菌数甚至弧菌数的繁殖，将异养菌或者弧菌的生长压制到一定数量之下，防止它们达到暴发疾病的临界值。

蛭弧菌虽然表达了很好的效果，但还要看一些公司的产品质量，因此建议大家要会初步的使用平板，并且通过对比和多试验组判定效果。另外使用蛭弧菌也要记准一点，不会有万能的产品，只会有合适的产品，多种方法、多种产品的配合可能会达到更好的效果。