应激宁质量标准研究

2020-08-25

当代水产 2020年7期

关键词：郁金姜黄刻度

图1 郁金的薄层色谱鉴定图（紫外光）

图2 姜黄的薄层色谱鉴定图（日光及紫外光）

图3 对照品

图4 阴性对照

图5 样品

应激宁是按中医药理血、平肝、补益、祛湿原理，筛选出以郁金、姜黄及刺五加三味中药组成的复方中药制剂，其中郁金作为理血药，起行气化瘀、疏肝利胆等作用；姜黄作为平肝药，主治气滞血瘀，以活血为主，兼可行气；刺五加作为补益、祛湿药，具有益气健脾，补肾安神的功能。现代研究表明，郁金具有保护肝细胞、增加肝酶活性、促进肝细胞再生、抗氧化、改善血液流变性等作用；姜黄主要成分为姜黄酮、姜黄素，具有改善肝胆实质细胞病损、利胆促代谢、抗炎、抗氧化等多种功效；刺五加具有抗应激、改善内分泌和对病理过程起调节作用，三味药合用共同发挥其疏肝利胆，抗应激之功效，从而增强鱼体抗病力。为有效控制该制剂的质量，对其进行定性鉴别和定量分析研究，结果显示，制剂中郁金和姜黄薄层鉴别特征明显，阴性无干扰；采用高效液相色谱法测定制剂中姜黄素含量简便准确，重复性好。

1 仪器与试药

岛津LC-10AT型高效液相色谱仪，十万分之一天平（METTLER TOLEDO XS205）。色谱柱：十八烷基键合硅胶柱（ExformmaC18 色谱柱，4.6×250mm，5μm）。应激宁（武汉华扬药业有限责任公司），姜黄素标准品：LOT：110823-201004，中国药品生物制品检定所。甲醇（国药试剂）色谱纯，乙腈（国药试剂）色谱纯，冰乙酸（国药试剂）色谱纯。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 郁金薄层鉴别

取应激宁样品3批及阴性对照5g，加无水乙醇25mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取郁金对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）为展开剂，预饱和30min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。置日光和紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点和荧光斑点。

2.1.2 姜黄薄层鉴别

取应激宁样品3批及阴性对照0.6g，加无水乙醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取姜黄对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液。再取姜黄素对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.5mg，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各4μL，分别于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）为展开剂，展开，取出，晾干，分别置日光下和紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点和荧光斑点。

2.2 姜黄素含量测定

2.2.1 溶液的制备

标准储备液制备：精密称取姜黄素对照品10.12mg（对照品含量为98.8%），置100ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，得标准品储备液（100μg/mL）。

样品溶液制备：取本品细粉约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤。精密量取1mL滤液，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液的制备：根据样品处方，制备不含姜黄药材的阴性样品，按样品溶液制备方法进行样品处理。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱（ExformmaC18 色谱柱，4.6×250mm，5μm），流动相：乙腈-4%冰醋酸溶液（48∶52），流速：1.0 mL/min，检测波长：430nm，柱温：35℃，进样量：20μL。

2.2.3 系统适用性

取上述对照样品、样品溶液、阴性对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，结果见图3～图5。姜黄素的保留时间为16min，图谱表明阴性对照液色谱无干扰，理论塔板数（以姜黄素计算）不低于8,000。

2.2.4 线性关系考察

精密称取姜黄素对照品10.12 mg（对照品含量为98.8%），置100mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，得标准品储备液（100μg/mL）。

精密吸取上述溶液0.25、0.5、1、2、4、5mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度依次2.5、5、10、20、40、50μg/mL的标准品溶液。各取20μl进样，记录色谱图，由峰面积A对溶液浓度C进行线性回归，y= 99907x+51179，R2=0.999，在2.5～50μg/mL浓度间，标准曲线的R2=0.999，本法的线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

取5、10、20μg/mL三个浓度的样品在1d内分别重复进样5次，在第1、3、5d内分别每天1次重复进样，测定日内及日间RSD，结果见表1和表2。

2.2.6 稳定性试验

取20180125批号金黄疏肝应激散样品，按供试品项下方法处理后，分别避光放置0，4，8，12和24h后进行测定，考察溶液的稳定性，不同时间点主峰出峰时间一致，峰面积近似相等，样品在48h内稳定。

2.2.7 最低检测限

以信噪比为2∶1时相应浓度确定检测限。姜黄素的最低检测限为0.01μg/mL。

2.2.8 回收率试验

精密称取姜黄素2mg、2.5mg和3mg分别置于三个具塞锥形瓶中，分别加入处方量的郁金和刺五加，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤。精密量取1mL滤液，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按上述测定法测定，计算回收率，结果见表4。表明，高、中、低三种浓度的回收率在94.31%以上，符合规定。

2.2.9 含量测定

色谱条件与系统适用性试验以C18硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-4%冰醋酸溶液（48∶52）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为430nm。理论塔板数按姜黄素峰计算不低于4,000。

对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥恒重的姜黄素对照品10mg，置100mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，得标准品储备液（100μg/mL）。精密吸取上述溶液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度10μg/mL的标准品溶液，取20μL进样。

表1 姜黄素日内变异系数（n=5）

表2 姜黄素日间变异系数

表3 溶液稳定性考察结果

表4 姜黄素回收率试验结果（n=3）

表5 三批中试样品姜黄素含量测定结果

供试品溶液的制备：精密称取三批中试（批号：20180125、20180126、20180127）金黄疏肝应激散样品各0.6g，平行操作2份。置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤。精密量取1mL滤液，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按外标法以峰面积计算样品中姜黄素的含量。结果见下表5。