五味子醇乙对大鼠离体胸主动脉内皮依赖性血管舒张作用的研究

许智莹，杨 硕，林程程，杨 波，孙靖辉，李 贺，王春梅，陈建光

(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

五味子始载于《神农本草经》，为木兰科藤本植物五味子的成熟干燥果实，其药用价值极高.据2015版中国《药典》记载，五味子五味具备，唯酸独胜，虽曰性温，但温而能润，上能敛肺气而止咳喘，下能滋肾水以固涩下焦，内能益气生津，宁心止烦渴，外能收敛止汗[1].木脂素类是五味子的主要功效成分，其中五味子醇乙是一种分子量为416.47 kDa的联苯环辛二烯类小分子木脂素.有研究[2-3]证明：五味子及其有效成分五味子醇乙可有效治疗心血管疾病，但其作用机制尚不明确.本研究采用离体血管灌流实验方法，通过血管条张力的变化，观察五味子醇乙对大鼠离体胸主动脉条的直接作用及对去氧肾上腺素预收缩血管条张力的影响，并对其作用机制进行初步探讨，为五味子在心血管疾病方面的研究与应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

五味子醇乙(SchisandrolB，成都普菲德生物技术有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)、去氧肾上腺素、氯乙酰胆碱(国药集团化学试剂有限公司)；左旋精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(Sigma-Aldrich公司，美国)；盐酸罂粟碱注射液(东北制药集团沈阳第一制药有限公司).

1.2 大鼠离体胸主动脉条制备

取体质量为250～280 g的雄性大鼠(长春亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证编号：SCXK(吉)2018-0007)，用25%的乌拉坦(4 mL/kg)进行麻醉，腹主动脉采血后处死，迅速分离出胸主动脉，放入4 ℃的Ringer-Locke营养液(NaCl 120 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，NaHCO325.0 mmol/L，葡萄糖5.6 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.2 mmol/L，MgSO4·6H2O 1.0 mmol/L)中，去除血管周围组织后，将动脉螺旋切成条状，长约10 mm，宽约2 mm.在操作过程中，避免用力牵拉，以防止损伤血管内皮.用棉球轻柔地摩擦血管条内皮表面，制备去内皮型血管条，然后将血管条的上端连接到张力传感器(成都泰盟生物技术有限公司)上，静息张力调节至1.5 g.动脉条在37 ℃恒温浴槽中平衡30 min，期间每10 min更换一次预热的营养液，并向浴槽内持续通入混合气体(95%O2和5%CO2).使用BL-420F生物机能信号采集系统(成都泰盟生物技术有限公司)记录动脉条张力变化，待血管条张力稳定后，向浴槽内加入终浓度为30 mmol/L的KCl刺激2次，血管收缩稳定后，更换新鲜的营养液.所有动物实验均经北华大学实验动物伦理委员会批准.

1.3 内皮完整性检测

应用去氧肾上腺素(10-6mol/L)预收缩大鼠胸主动脉条，待张力稳定后，依次加入终浓度为10-9～10-5mol/L的氯乙酰胆碱诱导血管舒张反应，氯乙酰胆碱引起的血管最大舒张率大于90%可认为内皮完整，小于10%则认为内皮已去除.在每个系列实验结束时，向浴槽内加入终浓度为10-4mol/L的罂粟碱，以引起最大舒张反应.

1.4 五味子醇乙对大鼠胸主动脉条张力的影响

取内皮完整的胸主动脉条，在静息状态下，采用累计给药法逐步加入五味子醇乙溶液，使浴槽内药物终浓度依次递增为 10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L，对照组加入等容量的DMSO，记录每次加入药物后血管条张力的变化.

1.5 五味子醇乙对去氧肾上腺素预收缩胸主动脉条张力的影响

应用去氧肾上腺素(10-6mol/L)预收缩内皮完整和去内皮型血管条，待收缩幅度稳定后，累积加入 10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L的五味子醇乙溶液，观察并记录胸主动脉条的张力变化，计算舒张率.舒张率=(去氧肾上腺素诱发最大收缩张力-加入五味子醇乙后的血管张力)/(去氧肾上腺素诱发最大收缩张力-加入罂粟碱后的血管张力)×100%[4]，并绘制五味子醇乙作用的量效关系曲线.

1.6 五味子醇乙对L-NAME和吲哚美辛预处理胸主动脉条张力的影响

应用L-NAME(10-4mol/L)、吲哚美辛(10-5mol/L)和蒸馏水(对照组)分别孵育内皮完整型血管条10 min，然后应用去氧肾上腺素预收缩血管条，待张力稳定后，累积加入 10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L的五味子醇乙溶液，记录胸主动脉条的张力变化，计算血管舒张率，并绘制量效关系曲线.

1.7 胸主动脉条eNOS mRNA的测定

分别用五味子醇乙(10-3mol/L)和DMSO孵育(对照组)胸主动脉条10 min，提取大鼠胸主动脉组织中总RNA，并按照HiScript®Ⅱ一步法RT-PCR试剂盒的说明进行反转录和扩增，将5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(电压100 V，40 min).实验结果采用Tanon 1600凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)进行观察、拍照和分析.

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 五味子醇乙对静息状态下血管条张力的影响

在浴槽中累积加入五味子醇乙药物溶液，使其终浓度为10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L.与DMSO对照组比较，不同浓度五味子醇乙对大鼠胸主动脉条张力无显著影响.结果见图1.

2.2 五味子醇乙抑制去氧肾上腺素诱导的血管条预收缩反应

累积浓度的五味子醇乙可剂量依赖性地降低去氧肾上腺素预收缩血管条的张力，且五味子醇乙对内皮完整型血管条的最大舒张率为(38.43 ±3.54)%(P<0.001)，对去内皮型血管条张力无显著影响.见图2.

2.3 阻断NO和前列环素对五味子醇乙舒张血管作用的影响

与对照组比较，在去氧肾上腺素预收缩的情况下，用NO合酶抑制剂L-NAME预处理胸主动脉条可显著减弱五味子醇乙的舒张作用，最大舒张率降为(28.07±2.60)%，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，提示五味子醇乙对内皮完整型血管条的舒张作用与促进NO的合成有关.采用吲哚美辛预孵育血管条后，与对照组比较，五味子醇乙的血管舒张作用无显著变化，提示五味子醇乙的内皮依赖性血管舒张作用可能与前列环素的生成无关.见表1、图3.

表1 L-NAME、吲哚美辛对五味子醇乙舒张血管作用的影响

2.4 五味子醇乙对胸主动脉条eNOS mRNA表达的影响

与对照组比较，用五味子醇乙孵育的胸主动脉条eNOS mRNA的表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明五味子醇乙引起的内皮依赖性血管舒张作用可能与上调eNOS mRNA的表达、促进NO合成有关.见图4.

3 讨 论

高血压是我国常见的心血管疾病之一，长期处于高血压状态容易引发心、脑、肾和血管等靶器官不同程度的损害，严重危害人类的健康[4-5].利用天然药物资源，提取分离出高效低毒的可用于防治心血管疾病的活性成分具有一定的研究前景.五味子含木脂类、多糖类、挥发油、三萜、有机酸、氨基酸和无机元素等有效成分[6-7].有研究[8]表明五味子具有降压的作用，而且效果理想.在韩国，五味子用于治疗妇女更年期综合征引起的心血管疾病历史悠久[9].五味子醇提物能够舒张去氧肾上腺素预收缩的离体大鼠胸主动脉环[10]，但其舒张血管的具体成分尚不明确.本研究选用了五味子木脂素的主要活性成分之一五味子醇乙，发现其对胸主动脉条的基础张力并无显著影响，但能抑制去氧肾上腺素引起的内皮完整型胸主动脉条的收缩反应，且具有浓度依赖性，提示五味子醇乙具有内皮依赖性血管舒张作用.

血管内皮能够合成和释放NO、前列环素等血管舒张因子.NO是在内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的作用下由左旋精氨酸转化而成，可通过激活平滑肌细胞鸟苷酸环化酶，引起环鸟苷酸含量升高，使细胞内钙离子减少，进而引起血管平滑肌舒张[11].本研究采用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME孵育后，五味子醇乙可显著减弱去氧肾上腺素预收缩胸主动脉条的舒张作用，并且发现五味子醇乙可显著提高胸主动脉eNOS mRNA的表达，说明五味子醇乙引起的内皮依赖性血管舒张作用可能与NO的释放有关.环氧化酶(COX)是合成前列环素的主要限速酶之一，也是血管内皮细胞生成前列环素的关键酶.采用环氧合酶抑制剂吲哚美辛孵育后，发现五味子醇乙对胸主动脉条的舒张作用无显著改变，说明前列环素可能没有参与五味子醇乙引起的内皮依赖性血管舒张反应.

本研究通过离体实验初步证实了五味子醇乙具有内皮依赖性血管舒张作用，其是否是五味子治疗高血压等心血管疾病的物质基础，我们将在后续的研究中建立高血压等疾病动物模型进一步验证.